桑葉黃酮和多糖對糖尿病大鼠血清腫瘤壞死因子-α、C反應蛋白含量及腎功能的影響

黃立佳 杜月光 孫梽均 周宏明 呂 勃 沈晨璐 鮑徐敏

(浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江 杭州 310053)

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桑葉黃酮和多糖對糖尿病大鼠血清腫瘤壞死因子-α、C反應蛋白含量及腎功能的影響

黃立佳 杜月光1孫梽均 周宏明 呂 勃 沈晨璐2鮑徐敏

(浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江 杭州 310053)

目的 研究桑葉黃酮和多糖對糖尿病(DM)大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α和C反應蛋白(CRP)含量及腎功能的影響。方法 SD大鼠用高脂高糖飼料加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。將SD大鼠隨機分為正常組、模型組、桑葉黃酮治療組、桑葉多糖治療組。檢測血糖、血尿素氮、血肌酐、檢測24 h尿蛋白定量、計算腎指數；采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測大鼠血清中的CRP和TNF-α的含量。結果 ①模型組大鼠血糖、腎指數、24 h尿蛋白定量、血尿素氮和血肌酐與正常組大鼠比較均明顯升高(P<0.01)，而桑葉黃酮治療組和桑葉多糖治療組明顯低于模型組(P<0.01)。②模型組大鼠血清中CRP和TNF-α的含量明顯高于正常組(P<0.01),而桑葉黃酮治療組和桑葉多糖治療組低于模型組(P<0.05或P<0.01)。③桑葉黃酮和桑葉多糖可減輕腎臟病理變化。結論 桑葉黃酮和多糖可能通過下調糖尿病大鼠血清中TNF-α和CRP的含量，改善炎癥反應，從而對腎臟起到保護作用。

糖尿病腎病；桑葉黃酮；桑葉多糖；腫瘤壞死因子α；C反應蛋白

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)主要的微血管并發癥，也是終末期腎衰竭(ESRF)的主要原因。目前普遍認為糖脂代謝紊亂引起的免疫炎癥反應在DN發生發展過程中發揮著重要作用。炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α及C反應蛋白(CRP)可引起局部炎癥，導致血管內皮細胞功能障礙或直接損傷血管內皮細胞等，與DN的發生發展密切相關。研究發現桑葉黃酮(MLF)和桑葉多糖(MLP)具有降血糖、抗炎癥的功能〔1～4〕，但對其是否可防治DN的相關研究尚甚少，本研究旨在通過觀察CRP和TNF-α在DN大鼠血液中的含量，研究桑葉黃酮和多糖對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及從炎癥角度探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、飼養條件和飼料 32只健康SPF級雄性SD大鼠，體重(220±20)g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。飼養條件：清潔級實驗飼養室，溫度(23±2)℃，濕度50%～70%,分籠飼養，自由攝水飲食，自然晝夜光線照明。高脂飼料配方：膽固醇1%，膽鹽0.1%，豬油10%，蛋黃粉5%，全脂奶粉5%,普通飼料78.9%。

1.2 藥物與試劑 MLP和MLF(購于南京澤朗醫藥科技有限公司，MLP批號：ZL130915268，MLP批號：ZL131023596)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，CRP和TNF-α檢測試劑盒(杭州誠維生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器 羅氏卓越型血糖儀及試紙；日立7020全自動生化分析儀；Thermo牌Varioskan Flash型酶標儀；Motic牌BA210型光學顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 動物模型復制 將大鼠適應性喂養1 w后，禁食16～18 h。將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH4.5)，配成1%的溶液，按30 mg/kg單次尾靜脈注射，注射當天開始給予高糖高脂飼料飼養。1個月后尾靜脈取血測定血糖，隨機血糖>16.7 mmol/L，持續3 d，確定為DM大鼠模型。

1.4.2 分組與給藥 DM模型復制成功后，隨機分為模型組，治療組和MLP治療組，每組各8只，同時設立正常組。正常組給予普通飼料喂養，模型組和治療組繼續給予高脂高糖飲食。治療組根據以往經驗，MLF治療組給予MLP 40 mg/kg灌胃，MLP治療組給予MLF 150 mg/kg灌胃；模型組和正常組給予3 ml蒸餾水灌胃，每日1次，連續8 w。

1.4.3 檢測指標及方法 于給藥8 w后，以20%烏拉坦1.5 g/kg腹腔內注射麻醉后，心臟抽血，處死大鼠。摘取腎臟，去除包膜，稱重，作長軸方向對切。取部分腎臟固定于10%甲醛緩沖液中供病理檢測。

1.4.3.1 一般情況觀察 每日觀察大鼠精神狀態、活動狀況、毛發及體重、排便情況。

1.4.3.2 生化指標檢測 應用全自動生化分析儀測定空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及24 h尿蛋白定量(U-TP)等生化指標。利用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法測定血液中CRP和TNF-α的含量，并分別記錄。

1.4.3.3 腎臟組織病理觀察與分析 腎組織經10%中性甲醛固定，脫水，再石蠟包埋與切片，行HE染色，光鏡下觀察腎臟組織形態學改變。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 正常組大鼠精神狀態良好，毛色白且致密，有光澤，反應靈敏，活動正常。模型組大鼠精神萎靡，行動遲緩，毛發雜亂、短豎、無光澤，表現為多飲、多食、多尿、消瘦。MLF治療組和MLP治療組大鼠精神狀況較好，反應較靈敏，毛色可，體重較模型組大鼠有所增加，反應靈敏度較正常組差，但仍高于模型組。

2.2 各組大鼠生化標指檢測 模型組GLU、BUN、Cr、腎指數、U-TP均高于正常組(P<0.01),與模型組比較，MLF治療組和MLP治療組的GLU、BUN、Cr、腎指數、U-TP均明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.3 各組大鼠血液TNF-α和CRP的含量 模型組血液TNF-α和CRP的含量明顯高于正常組(P<0.01)，而MLF治療組和MLP治療組血液TNF-α和CRP的含量低于模型組(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.4 各組大鼠腎組織病理變化 光鏡下HE染色可見正常組大鼠腎小球內毛細血管腔張開,系膜區基質均勻，腎小管結構正常。模型組可見腎小球體積增大，系膜細胞增多，基底膜增厚，系膜區基質增多,使血管腔變小,部分腎小管上皮細胞呈空泡變，間質可見有少量炎細胞浸潤。治療組以上病變有不同程度的減輕。

表1 各組生化指標、血液TNF-α和CRP的含量比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

3 討 論

DN的病理基礎是腎小球和腎小管間質細胞外基質(ECM)進行性積聚。研究證實〔5〕炎癥因子在DN 發病機制中具有非常重要的作用，可通過多種機制促進腎小球肥大和巨噬細胞在腎組織中的浸潤，刺激ECM合成并抑制其降解， 促進腎小球硬化和間質纖維化的發生，導致蛋白尿的發生及腎臟衰竭。

TNF-α是細胞因子網絡的一個重要成員，可由體內多種細胞產生，可介導生長調節，炎癥、免疫調節等多方面效應。在高血糖刺激下血流動力學改變、糖基化終末產物(AGEs)、代謝紊亂均可使腎臟局部釋放TNF-α〔6〕。TNF-α通過以下機制引起DN的發生〔7,8〕：①誘導產生氧自由基引起氧化應激；②增加系膜細胞cAMP及cGMP的合成，促進系膜細胞合成前列腺素和血小板活化因子增多，促進血栓形成，使系膜細胞結構和形態發生改變；③提高系膜細胞單核細胞趨化因子(MCP)-1的表達和分泌，促進DN產生；④TNF-α可直接誘導細胞凋亡；⑤誘導細胞間黏附分子(ICAM)-1的表達；⑥刺激瘦素的分泌。

CRP是由肝臟合成的一種急性期反應蛋白，CRP不僅是炎癥標志物，而且其本身直接參與炎癥過程。正常時機體CRP含量甚微，當機體發生感染和炎癥等時CRP急劇上升。近年研究發現體內高水平CRP與DM有關，并且可能是DN發生發展的一個危險因素。CRP引起DN的機制〔7,9～11〕包括：①引起局部炎癥，導致血管內皮細胞功能障礙或直接損傷血管內皮細胞，導致微血管病變；②降低內皮型一氧化氮合酶的表達及生物學活性；③參與氧化應激，使低密度脂蛋白被氧化為氧化低密度脂蛋白，后者可增強單核細胞對血管內皮的黏附和浸潤；④刺激血管內皮釋放炎癥因子ICAM-1,TNF-α及MCP-1等，促進白細胞釋放超氧化物和蛋白水解酶，引起組織損傷；⑤激活機體凝血和補體系統，打破機體凝血和纖溶系統的平衡，引發血管病變，最終導致DN發生。本實驗結果表明炎癥反應可能參與了DN的發生發展。

桑葉是常用中草藥之一，其中含有豐富的多糖和黃酮成分。近年來研究證實〔12〕，黃酮通過抗氧化機制清除自由基， 保持胰島β 細胞的結構完整維持其正常生理功能， 從而降低DM患者血糖水平， 防止并發癥的發生。MLP通過調節糖脂代謝，降低血糖、血脂和升高胰島素水平，但其是否對DN具有保護作用及其機制尚未見報道。本研究發現MLP可降低血糖，抑制腎臟肥大、降低尿蛋白， 防止DN的發生發展，并且可降低血中TNF-α和CRP含量。DM時高血糖、氧化應激等因素誘導大量炎癥介質釋放，加重腎臟炎癥反應，導致腎臟損傷。 由此我們推測，MLF和MLP對DN模型大鼠腎臟具有一定的保護作用，其保護機制可能與降低血糖水平及抗氧化作用，進而抑制炎癥因子TNF-α和CRP等的分泌有關，但這還有待進一步研究。

1 潘劍用,汪志平,黨江波，等.夏桑葉的體外抗氧化活性及其主要功能成分研究〔J〕.核農學報,2011；25(4):754-9,778.

2 李先佳,任麗平,于海英,等.桑葉總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島β細胞氧化損傷的影響〔J〕.醫藥導報,2013；32(6):701-4.

3 羅明琍,吳 薇,劉 偉，等.桑葉不同有效部位對2型糖尿病大鼠的降糖作用〔J〕.中國醫院藥學雜志,2013；33(15):1221-6.

4 任巖海,劉洪鳳,韓智學.桑葉多糖對2型糖尿病大鼠血糖血脂的影響〔J〕.中醫藥學報,2013；41(1):20-1.

5 Shikata K,Makino H.Microinflammation in the pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕.J Diabetes Invest,2013；4(2):142-9.

6 井 源，韓 婷.腫瘤壞死因子-α在糖尿病腎損害中的作用與機制〔J〕.國外醫學(老年醫學分冊),2009；30(2):78-80.

7 Mora C ,Navarro JF.The role of inflammation as a pathogenic factor in the development of renal disease in diabetes 〔J〕.Curr Diab Rep，2005；5(6)：399-401.

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12 薛淑萍,張立偉.桑葉總黃酮清除自由基作用研究〔J〕.山西師范大學學報(自然科學版),2009；23(4):66-8.

〔2015-05-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

浙江省新苗人才計劃項目(No.2013R410009)

1 基礎醫學院 2 護理學院

杜月光(1968-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事糖尿病及其并發癥的中醫藥防治的實驗研究。

黃立佳(1992-)，男，主要從事臨床醫學研究。

R363

A

1005-9202(2016)19-4703-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.013