益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-腎上腺素能受體、血清Ⅰ型前膠原羧基端肽和Ⅲ型前膠原氨基端肽的影響

楊冬花 顧廣富 羅建華

(貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002)

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益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-腎上腺素能受體、血清Ⅰ型前膠原羧基端肽和Ⅲ型前膠原氨基端肽的影響

楊冬花 顧廣富1羅建華

(貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002)

目的 探討益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-腎上腺素能受體(β3-AR)、血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP) 和Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNP)的影響。方法 通過異丙腎上腺素(ISO)誘導慢性心力衰竭動物模型。計算左、右心室心肌的心臟指數(LVMI、 RVMI)，應用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清PⅠCP和PⅢNP含量，以逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法以及Western印跡法檢測β3-AR mRNA及蛋白質表達水平。結果 與正常組比較，模型組LVMI 〔(2.987±0.318 vs 2.350±0.468)mg/g〕、血清PⅠCP〔(16.357±3.650 vs 12.843±3.124)pg/ml〕、PⅢNP〔(64.984±17.477 vs 21.245±5.354)pg/ml〕含量及β3-AR mRNA(0.888±0.064 vs 0.743±0.086)與蛋白質(4.413±0.729 vs 2.312±0.394)的表達水平明顯升高(均P<0.05)；益氣溫陽活血方能夠明顯降低慢性心力衰竭大鼠LVMI，減少PⅠCP和PⅢNP含量，抑制β3-AR mRNA與蛋白質表達水平的升高，與正常組比較〔(2.557±0.379 vs 2.350±0.468)mg/g〕、血清PⅠCP〔(13.111±2.758 vs 12.843±3.124)pg/ml〕和PⅢNP〔(25.967±9.659 vs 21.245±5.354)pg/ml〕含量及β3-AR mRNA(0.781±0.067 vs 0.743±0.086)與蛋白質(2.484±0.642 vs 2.312±0.394)，均無顯著性差異(P>0.05)。結論 益氣溫陽活血方可能通過抑制β3-AR的表達減少PⅠCP和PⅢNP含量逆轉心室重塑，改善心臟功能。

慢性心力衰竭；心室重塑；β3-腎上腺素能受體； PICP；PⅢNP；益氣溫陽活血方

心室重塑和神經激素-細胞因子之間的惡性循環是心力衰竭發生發展的基本機制，是導致心力衰竭不斷進展的病理生理學基礎〔1〕。β3-腎上腺素能受體(β3-AR)是新近發現的β腎上腺受體(β-AR)，在心力衰竭晚期可產生持續的負性肌力作用，導致心肌抑制，加重心力衰竭〔2〕。既往研究發現，益氣溫陽活血方在心力衰竭早期可通過過氧化物酶體增殖物活化物受體(PPAR)γ信號通路調節血管緊張素Ⅱ、醛固酮的表達，防止心室重塑，改善心臟功能〔3〕，但是否能通過抑制心力衰竭持續高表達的β3-AR水平防止心室重塑，目前尚不清楚。本研究通過觀察益氣溫陽活血方對慢性心衰心室重塑大鼠β3-AR表達水平的影響研究，為進一步臨床運用提供理論依據和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar雄性大鼠40只，清潔級，鼠齡5～6個月，體重(250±10)g，由貴陽醫學院實驗動物學部提供，合格證號：SYSK(黔)2002-0001。

1.2 益氣溫陽活血方主要成分 人參、黃芪、丹參、益母草各30 g，白術、茯苓各15 g，桂枝9 g等11味中藥。藥材從貴州省人民醫院中藥房一次性選購，生藥按比例取好，加水浸泡1 h，第一遍煮沸40 min，濾渣取汁；再加水煮沸15 min，濾渣取汁，合并2次煎液，在水浴中濃縮至每毫升煎液含生藥4 g，保存備用。

1.3 試劑與儀器 異丙腎上腺素(Sigma公司)，卡維地洛(齊魯制藥有限公司，批號：H20000100)，Trizol(Invitrogen公司)， Rnasin(Promega公司)，M-MLV(Promega公司)，引物由上海生物工程公司合成，大鼠抗-β3-AR抗體(Abcam公司)，ECL顯影試劑盒(Santa Cruz 公司)，Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)和Ⅲ型前膠原氨基端肽(PCⅢNP)檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)，制膠、電泳及轉膜儀(Bio-Rad公司)，PCR儀(Eppendorf 公司)，酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 心力衰竭的模型制備〔4〕及分組 采用異丙腎上腺素腹腔注射(3 mg·kg-1·d-1)誘導慢性心力衰竭模型。選用Wistar雄性大鼠，隨機分組為正常組，模型組，中藥組(益氣溫陽活血方治療組)，西藥組(卡維地洛治療組)，每組10只，模型組、中藥組及西藥組根據上述方法制備慢性心力衰竭動物模型。造模后第1天中藥組及西藥組即分別給予益氣溫陽活血方(8 ml/kg)和卡維地洛(50 mg/kg)灌胃治療，2次/d，正常組及模型組則以蒸餾水等量灌胃，共治療8 w。

1.4.2 左、右心室心肌的心臟指數(LVMI、RVMI) 試驗結束后，開胸取出心臟，灌洗后分別稱取左心室、右心室濕質量。以左心室濕質量/體質量和右心室濕質量/體質量，分別代表LVMI、RVMI，可反映心室重塑情況。

1.4.3 血清PⅠCP和PⅢNP檢測 4組動物相應時間處死后，采集頸動脈血分離血清，以ELISA法檢測上述指標，操作過程參照試劑盒說明進行。

1.4.4 心肌組織β3-AR mRNA的表達 β3-AR (444 bp)上游5′-AGTGGGACTCCTCGTAATG-3′，下游5′-CGCTTAGCTAC GACGAAC-3′。GAPDH (187 bp):上游5′-GACAACGGCTCCGGCATGTG-3′，下游5′-TGAGGATGCCTCTCTTGC-3′。按Trizol試劑說明書提取左室心肌組織總RNA，參照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉錄反應，然后進行PCR反應。取PCR產物5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測定條帶的吸光度(A)值，以目的基因與GAPDH條帶的吸光度(A)值的比值代表其表達的相對量。

1.4.5 心肌組織β3-AR蛋白質的表達 提取左心室組織蛋白質，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉膜。一抗濃度均為1∶1 000，二抗濃度為1∶2 000，化學發光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統進行密度掃描并分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 大鼠心室重塑指標、血清PⅠCP和PⅢNP含量的變化 模型組大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(P<0.05)。中藥組、西藥組大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量與正常組比較，無顯著差異(P>0.05)。中藥組大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量與西藥組比較，無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組心室重塑指標、血清PⅠCP和PⅢNP含量、β3-AR mRNA和蛋白質表達量的比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

1：分子量標準；2：正常組；3：模型組；4：中藥組；5：西藥組圖1 β3-AR mRNA的表達

1：正常組；2：模型組；3：中藥組；4：西藥組圖2 β3-AR 蛋白質的表達

2.2 各組心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質的表達水平 圖1，圖2可見，模型組大鼠心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質的表達水平與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(均P<0.05)。中藥組、西藥組心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質的表達水平與正常組比較，無顯著差異(均P>0.05)。中藥組心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質的表達水平與西藥組比較，無顯著差異(均P>0.05)。

3 討 論

β-AR是一類膜表面糖蛋白，可識別并與兒茶酚胺特異性結合，激活胞內信號轉導，從而產生一系列生理生化反應〔5〕。根據各亞型對特異性配體的親和性、生物學效應、基因結構和信號轉導機制，β-AR主要分為β1-AR、β2-AR、和β3-AR〔6〕。β1-AR激動后可增強心肌收縮力，但持續活化可引起心肌肥厚、間質纖維化和心肌細胞凋亡等心室重塑慢性效應〔7〕，β2-AR則不但具有抗凋亡的作用，還輕度增加心肌收縮力，對心臟具有保護作用〔8〕。Gauthier等〔9〕首先發現人類心室肌組織存在介導負性變力效應的β3 -AR。β3-AR介導負性肌力作用，在心力衰竭早期，β3-AR上調可保護心臟免于高水平兒茶酚胺所致的心臟損傷，但當心力衰竭進展到終末階段時，持續激活的β3-AR的負性變力效應可抑制心肌收縮，導致心功能惡化〔2〕，在大鼠終末期衰竭心臟，β3-AR激動劑可明顯惡化心功能并可誘導心肌細胞凋亡〔10〕。同時還能通過β3-AR信號通路級聯放大效應，通過相關信號轉導通路進而活化多種心肌肥大相關基因，如腫瘤壞死因子α、內皮素-1、血管緊張素Ⅱ等的表達促進心室重塑〔11〕。

心肌細胞外間質的主要成分是膠原纖維，其中以Ⅰ型與Ⅲ型膠原為主，心室重塑時，心肌總膠原含量增加，或者Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加將導致心肌僵硬度增加、 心肌舒張功能受損〔12〕。PⅠCP和PⅢNP是在特殊肽鏈內切酶的作用下脫離前膠原以游離形式被釋放入血的肽段，其釋放與膠原纖維的生成是1∶1的關系，所以兩者隨著膠原合成增多其釋放增加，它們被認為是體內Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的間接標志，可作為反映心臟膠原重塑的指標〔13〕。

目前心力衰竭的治療目標不僅是要改善患者的癥狀、提高生活質量，更重要的是修復衰竭心肌的生物學性質，阻斷神經內分泌、細胞因子的激活和心室重塑之間的惡性循環〔14〕。慢性心力衰竭的治療通過阻斷β受體策略不斷得到大規模臨床實驗的印證，β受體阻滯劑防止心室重塑已經成為心力衰竭治療的基石。卡維地洛是一種具有多種附加作用的第三代β受體阻滯藥，是非選擇性地阻滯β受體及選擇性地阻滯α1受體，對心力衰竭具有明顯的治療效果和良好的安全性，卡維地洛已被美國FDA批準為治療心力衰竭的首選β受體阻滯劑。研究發現，異丙腎上腺素灌流離體大鼠心臟，心衰組用卡維地洛后心功能指標明顯改善，與特異性的β3-AR抑制劑SR59230A作用于離體大鼠心臟后心功能指標的變化差異無統計學意義〔15〕；而且卡維地洛還能使大鼠衰竭心室β3-AR mRNA表達明顯降低、減輕心室重塑〔16〕。從而可以推斷卡維地洛可通過阻斷β3-AR發揮治療心力衰竭的作用。

益氣溫陽活血方是一組針對心力衰竭病機所組成的臨床有效方劑，方中主要成分人參、黃芪、丹參、益母草、白術、茯苓、桂枝等11味中藥，具有益氣溫陽、活血利水之功效。本研究結果顯示，益氣溫陽活血方與卡維地洛一樣，可以改善心力衰竭大鼠心臟功能，減輕左心室濕質量/體質量的比值，同時還能抑制β3-AR mRNA和蛋白質的表達，減少血清PⅠCP和PⅢNP的含量，防止心室重塑。初步可以推論，益氣溫陽活血方通過阻斷心力衰竭時過分激活的β3-AR，減少血清PⅠCP和PⅢNP血清含量，抑制膠原產生，逆轉心室重塑，從而改善心臟的收縮和舒張功能，具體作用機制有待于進一步研究證實。

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〔2015-04-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

貴州省社會公關項目(黔科合SY字〔2011〕3055)；貴州省科技聯合基金(黔科合SY〔2010〕3121號)

1 貴陽中醫學院2012級研究生

楊冬花(1971-)，女，主任醫師，醫學博士，主要從事心力衰竭的臨床與基礎研究。

R286

A

1005-9202(2016)19-4678-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.003