腦脈利顆粒中丹參酮ⅡA姜黃素人參皂苷Rg1含量測定

蘇梅，倪輝，秦引林，陳濤（江蘇柯菲平醫藥股份有限公司，江蘇南京210014）

腦脈利顆粒中丹參酮ⅡA姜黃素人參皂苷Rg1含量測定

蘇梅，倪輝，秦引林，陳濤
（江蘇柯菲平醫藥股份有限公司，江蘇南京210014）

目的建立腦脈利顆粒中丹參酮ⅡA、姜黃素、人參皂苷Rg1含量的測定方法。方法采用甲醇提取，并采用高效液相色譜法進行腦脈利顆粒中丹參酮ⅡA、姜黃素、人參皂苷Rg1含量測定。結果腦脈利顆粒中丹參酮ⅡA的含量為2.25 mg/10 g，姜黃素的含量為0.47 mg/10 g，人參皂苷Rg1的含量為12.53 mg/10 g。結論高效液相色譜法簡便、靈敏、準確，無干擾測定，可用于腦脈利顆粒制劑中丹參酮ⅡA、姜黃素、人參皂苷Rg1的含量測定。

色譜法，高壓液相；丹參酮ⅡA；姜黃素；人參皂甙；腦脈利顆粒

腦脈利顆粒為純中藥制劑，源于“補陽還五湯”，加以藥味增減，適用于中風急性期經絡血瘀氣虛證[1]。處方主要成分：益母草、三七、黃芪、川芎、姜黃、紅花、丹參、赤芍、當歸、白芍、川牛膝等11味中藥，有效成分主要為鹽酸水蘇堿、益母草堿、人參皂苷Rg1、黃芪甲苷、芍藥苷、姜黃素、丹參酮ⅡA等單體成分。本研究旨在針對腦脈利顆粒中的丹參酮ⅡA、姜黃素、人參皂苷Rg1這3種有效成分進行含量測定，對腦脈利顆粒在藥理、臨床等方面的深入研究，以及該品種的推廣等具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料Agilent-1200高效液相色譜儀，Agilent OpenLAB CDS ChemStation色譜工作站。丹參酮ⅡA對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110766-200619）；姜黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110823-201004）；人參皂苷Rg1對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110703-201128）；乙腈（Merck公司，色譜純）；甲醇、乙酸、磷酸、正丁醇、氨水為國產分析純試劑；腦脈利顆粒（南京柯菲平盛輝制藥有限公司，規格：每袋10 g，批號：11140301）；重蒸水（自制）。

1.2方法

1.2.1丹參酮ⅡA的含量測定[2-3]

1.2.1.1色譜條件色譜柱：島津VP-ODS C18（150.0mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（60∶40）；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

1.2.1.2溶液的配制（1）對照品溶液的配制：精密稱取丹參酮ⅡA對照品20 mg于容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密移取上述溶液1 mL置于10 mL容量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.020 mg/mL丹參酮ⅡA的對照品溶液。（2）供試品溶液的配制：稱取腦脈利顆粒適量，研缽研細，精密稱取2 g，置50 mL錐形瓶，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，40℃下超聲30 min，冷卻至室溫，再稱定質量，甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

1.2.1.3系統適應性試驗精密吸取對照品溶液及供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。

1.2.1.4方法學考察（1）線性考察：精密稱取丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇定量稀釋，制成1.000 mg/mL的溶液；精密量取適量，定量稀釋，分別制成每毫升中含5、10、20、40、80 μg的溶液。按照1.2.1.1項下色譜條件測定，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y（mV）為縱坐標繪制標準曲線。（2）精密度試驗：按1.2.1.1項下色譜條件，取對照品溶液6份，進樣，測定精密度，計算相對標準偏差（RSD）。（3）重復性試驗：按1.2.1.1項下色譜條件，取供試品溶液共6份，進樣，測定重復性，計算RSD。（4）回收率試驗：取已知含量的供試品溶液6份，分別精密加入與樣品中丹參酮ⅡA含量相當的丹參酮ⅡA對照品，按1.2.1.1項下色譜條件測定，計算回收率。

1.2.1.5含量測定分別取上述對照及供試品溶液各2份，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，外標法計算含量。

1.2.2姜黃素的含量測定[4-6]

1.2.2.1色譜條件色譜柱：島津VP-ODS C18（150.0 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.5%冰乙酸溶液（45∶55）；檢測波長：430 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

1.2.2.2溶液的配制（1）對照品溶液的配制：精密稱取姜黃素對照品20 mg于容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密移取該溶液1 mL置50 mL容量瓶中，流動相稀釋至刻度，搖勻，制成0.004 mg/mL姜黃素對照品溶液。（2）供試品溶液的配制：取腦脈利顆粒適量，研缽研細，精密稱取2 g，置50 mL具塞錐形瓶，精密加入甲醇20 mL，稱定質量，40℃下超聲處理30 min，冷卻至室溫，稱定質量，甲醇補足減失質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過。精密移取續濾液5 mL置于10 mL容量瓶，流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.2.3系統適應性試驗精密吸取對照品溶液及供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。

1.2.2.4方法學考察（1）線性考察：精密稱取姜黃素對照品適量，2%甲醇定量稀釋，制成100 μg/mL的溶液；精密量取適量，分別定量稀釋，配制成每毫升中含1、2、4、8、16 μg的溶液。按照1.2.2.1項下色譜條件測定，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y（mV）為縱坐標繪制標準曲線，計算姜黃素回歸方程。（2）精密度試驗：按1.2.2.1項下色譜條件，取對照品溶液共6份，進樣，測定，根據峰面積計算姜黃素含量（n=6）計算RSD。（3）重復性試驗：按1.2.2.1項下色譜條件，取供試品溶液共6份，進樣，測定，計算RSD。（4）回收率試驗：取已知含量的供試品6份，各精密加入與樣品中姜黃素含量相當的姜黃素對照品，按照1.2.2.1項下的色譜條件測定，計算回收率。

1.2.2.5含量測定分別取上述對照品及供試品溶液各2份，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，外標法計算含量。

1.2.3人參皂苷Rg1含量測定[7-10]

1.2.3.1色譜條件色譜柱：InertSustain C18（150.0 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-pH2.0磷酸水緩沖溶液（19∶81）；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

1.2.3.2溶液的配制（1）對照品溶液的配制：精密稱取人參皂苷Rg1對照品20 mg于容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制成含人參皂苷Rg1 0.200 mg/mL的對照品溶液。（2）供試品溶液的配制：稱取腦脈利顆粒適量，研缽研細，精密稱取5 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，40℃下超聲處理30 min，冷卻至室溫，再稱定質量，甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾。精密移取續濾液20 mL，蒸發皿濃縮蒸干，殘渣加重蒸水30 mL溶解，轉移至250 mL分液漏斗中，用水飽和正丁醇振搖提取4次（30、30、20、20 mL），合并正丁醇液，20 mL氨試液洗滌，蒸干正丁醇液。流動相溶解殘渣并轉移至10 mL容量瓶，流動相稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

1.2.3.3系統適應性試驗精密吸取對照品溶液及供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。

1.2.3.4方法學考察（1）線性考察：精密稱取人參皂苷Rg1對照品適量，流動相定量稀釋制成每毫升中含1 mg的溶液；精密量取適量，分別定量稀釋，配制成每毫升中含50、100、200、400、800 μg的溶液。按照1.2.3.1項下色譜條件測定，以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y（mV）為縱坐標繪制標準曲線。計算人參皂苷Rg1回歸方程。（2）精密度試驗：按1.2.3.1項下色譜條件，取對照品溶液共6份，進樣，測定（n=6），根據峰面積計算RSD。（3）重復性試驗：按1.2.3.1項下色譜條件，取供試品溶液共6份，進樣，測定，計算RSD。（4）回收率試驗：取已知含量的供試品6份，分別精密加入與樣品中人參皂苷Rg1含量相當的人參皂苷Rg1對照品，按1.2.3.1項下色譜條件測定，計算平均回收率。

1.2.3.5含量測定分別取上述對照品及供試品溶液，各2份，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，外標法計算含量。

2　結果

2.1丹參酮ⅡA測定結果

2.1.1系統適應性試驗供試品在與對照品出峰相應的保留時間未出現雜質峰，此色譜條件下的分離度較好。結果表明，丹參酮ⅡA以外的其他成分對丹參酮ⅡA的測定無干擾。見圖1、2。

圖1　丹參酮ⅡA對照品高效液相色譜圖

圖2　丹參酮ⅡA供試品高效液相色譜圖

2.1.2方法學考察

2.1.2.1線性關系線性回歸方程為：Y=6 079.59X+ 30.50（r=0.999 7）。表明在0.1～1.6 μg時線性關系良好。

2.1.2.2精密度RSD為0.4%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.2.3重復性RSD為1.9%，表明方法重復性良好。

2.1.2.4回收率計算平均回收率為96.7%，RSD為3.6%。

2.1.3丹參酮ⅡA含量腦脈利顆粒中丹參酮ⅡA含量為2.25 mg/10 g。

2.2姜黃素測定結果

2.2.1系統適應性試驗供試品在與對照品出峰相應的保留時間未出現雜質峰，該色譜條件下的分離度較好。表明樣品中姜黃素以外的其他成分對姜黃素的測定無干擾。見圖3、4。

圖3　姜黃素對照品高效液相色圖譜

圖4　姜黃素供試品高效液相色譜圖

2.2.2方法學考察

2.2.2.1線性關系線性回歸方程為：Y=6 629.86X+ 140.60（r=0.999 6），表明姜黃素在0.02～0.32 μg時線性關系良好。

2.2.2.2精密度RSD為1.5%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.3重復性RSD為1.4%，表明方法重復性良好。

2.2.2.4回收率平均回收率為96.7%，RSD為2.3%。

2.2.3樣品中姜黃素含量腦脈利顆粒中姜黃素含量為0.47 mg/10 g。

2.3人參皂苷Rg1測定結果

2.3.1系統適應性試驗供試品在與對照品出峰相應的保留時間未出現雜質峰，該色譜條件下的分離度較好。表明制劑中人參皂苷Rg1以外的其他成分對人參皂苷Rg1的測定無干擾。見圖5、6。

圖5　人參皂苷Rg1對照品高效液相色譜圖

圖6　人參皂苷Rg1供試品高效液相色譜圖

2.3.2方法學考察

2.3.2.1線性關系線性回歸方程為：Y=220.7X+18.8（r=0.999 8）。表明人參皂苷Rg1在1～16 μg時線性關系良好。

2.3.2.2精密度RSD為2.4%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.3重復性RSD為2.3%，表明方法重復性良好。

2.3.2.4回收率平均回收率為97.8%，RSD為1.8%。

2.3.3樣品中人參皂苷Rg1含量腦脈利顆粒制劑中人參皂苷Rg1含量為12.53 mg/10 g。

3　討論

目前，國內有關腦脈利顆粒含量測定的相關報道不多，本研究采用了甲醇超聲提取，高效液相色譜法測定了腦脈利顆粒中丹參酮ⅡA、姜黃素；采用甲醇超聲，水飽和正丁醇萃取，高效液相色譜法測定了腦脈利顆粒中人參皂苷Rg1的含量。3個組分測定線性關系，r均在0.999以上。表明組分在濃度范圍內線性關系良好。丹參酮ⅡA：回收率RSD為3.6%；姜黃素：回收率RSD為2.3%；人參皂苷Rg1：精密度RSD為2.4%，重復性RSD為2.3%，其他方法學考察RSD均控制在2.0%以下，表明方法系統適應性良好。制劑中組分含量測定準確度高，方便、快捷，能有效控制腦脈利顆粒制劑的質量。由于處方中君藥為益母草，質量控制的主要指標為益母草中水蘇堿，標準中用薄層掃描法進行定量，誤差偏大；未來在制劑的標準提升中考慮用高效液相色譜法控制益母草中水蘇堿的含量。

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Determination of TanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 contents in Naomaili Granules

Su Mei，Ni Hui，Qin Yinlin，Chen Tao
（Jiangsu Carephar Pharmaceutical Co.，Ltd.，Nanjing，Jiangsu 210014，China）

Objective To establish a method for the determination of tanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 contents in Naomaili Granules.Methods The methanol extraction was adopted and the HPLC method was used to detect the contents of tanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 in Naomaili Granules.Results In Naomaili Granules，the tanshinoneⅡA content was 2.25 mg/10 g，the curcumin content was 0.47 mg/10 g and the Ginsenoside Rg1 was 12.53 mg/10 g.Conclusion

The HPLC method is simple，sensitive and accurate without interact interfering and can be used for the contents determination of tanshinoneⅡA，curcumin and ginsenoside Rg1 in Naomaili Granules.

Chromatography，highpressureliquid；Anshinone；Curcumin；Ginsenoside；Naomaili Granules

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.008

A

1009-5519（2016）21-3282-03

蘇梅（1974-），博士研究生，主要從事新藥開發工作。

（2016-03-30

2016-06-20）