腫瘤相關巨噬細胞和KIT評估胰腺神經內分泌腫瘤肝轉移及預后的價值

葉良濤 周泉波 葉會霖 鄭上游 陳汝福

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·論著·

腫瘤相關巨噬細胞和KIT評估胰腺神經內分泌腫瘤肝轉移及預后的價值

葉良濤 周泉波 葉會霖 鄭上游 陳汝福

目的 探討腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)結合3型酪氨酸激酶受體(KIT)對胰腺神經內分泌腫瘤(PNETs)肝轉移風險及預后的評估價值。 方法 收集1995年1月至2015年5月間中山大學孫逸仙紀念醫院行手術治療并經病理診斷證實的79例PNETs患者資料。采用免疫組化染色法檢測腫瘤組織CD68、KIT蛋白表達，分析其與腫瘤臨床病理參數的相關性。結果 79例PNETs中30例(38.0%)瘤組織CD68高表達，35例(44.3%)瘤組織KIT高表達。CD68高表達與腫瘤侵犯(P<0.001)、AJCC7th分期(P<0.001)、肝轉移(P<0.001)及其發生時間有關(P=0.019)；CD68低表達患者的生存期顯著長于高表達患者，差異有統計學意義(P=0.0002)。KIT高表達與WHO 2010及AJCC7th分期(P<0.001，P=0.002)、腫瘤無功能性(P=0.002)、肝轉移有關(P=0.026)；KIT低表達患者的生存期顯著長于高表達患者，差異有統計學意義(P=0.0013)。CD68、KIT均高表達患者常見于腫瘤侵犯者(P<0.001)，與WHO 2010、AJCC7th分期有關(P值均<0.001)；CD68、KIT均高表達患者的生存期顯著短于均低表達者，差異有統計學意義(P=0.0057)。多因素分析顯示AJCC7th分期Ⅳ期、CD68高表達是PNETs患者預后的獨立危險因素。結論 CD68、KIT高表達與PNETs分級分期、肝轉移風險、不良預后相關，CD68是預測PNETs預后的獨立危險因素。

胰腺神經內分泌腫瘤； 巨噬細胞； KIT； 預后； 腫瘤轉移

Fund Program: National Scientific Foundation of China(81370059)

胰腺神經內分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine tumors，PNETs)是一種罕見的、異質性腫瘤，占胰腺腫瘤的1.3%～10%，年發病率近年來逐步上升(0.94/10萬人)[1-3]。PNETs生物學行為復雜，臨床表現、治療及預后個體差異顯著，給臨床工作帶來巨大的挑戰[2,4]。傳統的內分泌瘤評價指標CgA、Syn、Ki-67、核分裂數等未能從分子機制的層面深入剖析PNETs，目前臨床上仍缺乏較為深入、客觀的預后評價指標[5]。腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是外周血單核細胞在腫瘤相關趨化因子的作用下遷移至腫瘤微環境中增殖、分化形成的[6]。研究表明，TAMs與PNETs的腫瘤進展、分期、術后肝轉移風險密切相關[1,5]。TAMs基本都表達CD68，因此普遍應用CD68作為檢測TAMs的標記物。近年來酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinases, RTKs)在腫瘤的發生和發展中發揮重要的調控作用。KIT原癌基因即3型RTKs，作為RTKs阻斷治療的分子靶點受到廣泛關注[7-8]。KIT突變與PNETs的發生、侵襲、復發轉移等事件聯系密切[4,8-9]。本研究旨在探討CD68、KIT作為PNETs的潛在生物標記，能否進一步優化PNETs預后的判斷標準，篩選出具有不良預后傾向的病例，以指導臨床診治與術后隨訪。

資料與方法

一、研究對象

收集1995年1月至2015年5月間廣州中山大學孫逸仙紀念醫院行手術治療且經病理證實的79例PNETs患者，臨床資料、隨訪及聯系方式齊全。診斷、分類、分期均符合2010年第4版WHO胰腺神經內分泌腫瘤的分類及命名標準[10](以下簡稱WHO 2010分期)、2011年中國胃腸胰神經內分泌腫瘤病理學診斷共識[11]、2010年AJCC第7版TNM分期標準[12](以下簡稱AJCC7th分期)、2014年胰腺神經內分泌腫瘤診治專家共識[13]。本研究為回顧性隊列分析，并通過孫逸仙紀念醫院倫理委員會審查通過。

二、免疫組化染色

取孫逸仙紀念醫院病理科保存的標本，切片后采用免疫組化染色Envision二步法檢測胰腺CD68、KIT表達。抗CD68抗體購自美國Dako公司。工作濃度1∶100；抗KIT抗體購自丹麥Dako Cytomation公司，工作濃度1∶200。胰腺組織嗜鉻粒蛋白A (chromogranin A, CgA)、突觸素(synaptophysin, Syn)、Ki-67表達的染色結果及相關數據均來源于病理科出具的病理報告。胞質或胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達。陽性細胞占總細胞數10%以下為低表達，以“-”表示，≥10%為高表達，以“+”表示。

三、隨訪情況

術后采用電話、門診復查的方式隨訪，截止時間為2015年5月31日。總生存期(overall survival，OS)指從住院到死亡或最后隨訪的時間。52例患者獲得有效隨訪，隨訪率為65.8%。

四、統計學處理

結果

一、臨床病理特征

79例PNETs患者中男性32例，女性47例，平均年齡56歲。腫瘤類型：胰島素瘤30例(38.0%)，無功能性腫瘤23例(29.1%)，內分泌癌16例(20.3%)，類癌3例(3.7%)，胰高血糖素瘤2例(2.5%)，胃泌素瘤2例(2.5%)，血管活性腸肽瘤1例(1.3%)，副神經節瘤1例(1.3%)，神經節瘤1例(1.3%)。腫瘤平均大小為3.02 cm。WHO 2010分期為G1期42例(53.2%)，G2期27例(34.2%)，G3期10例(12.6%)；AJCC7th分期為Ⅰ期35例(44.3%)，Ⅱ期25例(31.6%)，Ⅲ期9(11.4%)，Ⅳ期10例(12.7%)。同期肝轉移1例(1.3%)，術后肝轉移14例(17.7%)。手術方式：胰體尾切除術±脾切除術22例(27.8%)，胰十二指腸切除術19例(24.1%)，腫瘤剜除術16例(20.3%)，EUS-FNA術6例(7.6%)，保留幽門的胰十二指腸切除術6例(7.6%)，腹腔鏡胰十二指腸切除術5例(6.3%)，胰腺中段切除術2例(2.5%)，姑息性手術2例(2.5%)，內鏡下活檢術1例(1.3%)。

二、胰腺組織CD68、KIT表達

慢性胰腺炎組織中CD68弱陽性表達，KIT幾乎不表達；PNETs組織中CD68及KIT均陽性表達，且隨分期進展，陽性染色范圍及強度依次逐漸增強(圖1)。38.0%(30/79)PNETs患者CD68高表達，44.3%(35/79)KIT高表達。

圖1 慢性胰腺炎及PNETs G1、G2、G3期腫瘤組織CD68(1A、1B、1C、1D)、KIT(1E、1F、1G、1H)表達 (免疫組化 ×10)

三、CD68、KIT表達與臨床病理參數的相關性

CD68高表達與腫瘤遠處轉移、AJCC7th分期密切相關；KIT高表達與WHO 2010、AJCC7th分期密切相關，更常見于無功能性PNETs(表1)。

將79例PNETs根據低表達(-)、高表達(+)重新分組，CD68-/KIT-組26例(32.9%)、CD68-/KIT+組23例(29.1%)、CD68+/KIT-組18例(22.8%)、CD68+/KIT+組12例(15.2%)。CD68+/KIT+更常見于鄰近器官侵犯、遠處轉移者(P<0.001)，且與WHO 2010、AJCC7th分期密切相關(P值均<0.001，表2)。

表1 PNETs中CD68、KIT表達與腫瘤臨床病理參數的關系

臨床參數CD68表達-+P值KIT表達-+P值平均年齡(歲)54．156．50．335a55．757．20．742a性別(例) 女性31160．383b29180．193b 男性18141517腫瘤部位(例) 鉤突或胰頭21190．077b20200．302b 胰體尾28112415腫瘤侵犯范圍(例) 局限性455<0．001c29210．527c 侵犯鄰近器官4181210 遠處轉移0734WHO2010分期(例) G13570．469c366<0．001c G21017621 G34628AJCC7th分期(例) Ⅰ323<0．001c2690．002c Ⅱ11141213 Ⅲ2736 Ⅳ4637功能性腫瘤(例) 是27130．310b29110．002b 否22171524神經浸潤(例) 陰性28140．365b26160．237b 陽性21161819

注：-為低表達，+為高表達；a：Spearman秩相關檢驗；b：Pearson χ2檢驗；c：多組獨立樣本的秩和檢驗

表2 CD68、KIT雙表達與腫瘤臨床病理參數的關系

注：-為低表達；+為高表達； a：Spearman秩相關檢驗；b：Pearson χ2檢驗；c：多組獨立樣本的秩和檢驗

四、CD68、KIT與肝轉移及其發生時間的相關性

15例(19.0%)發生肝轉移者中13例(86.7%)CD68高表達，2例(13.3%)低表達；64例(81.0%)無肝轉移者中17例(26.6%)CD68高表達，47例(73.4%)低表達。15例肝轉移患者中11例(73.3%)KIT高表達，4例(26.7%)低表達；64例無肝轉移患者中24例(37.5%)KIT高表達，40例(62.5%)低表達。CD68、KIT高表達患者發生肝轉移例數顯著高于低表達者，差異均有統計學意義(χ2=16.173，P<0.001；χ2=4.955，P=0.026)。CD68高表達患者發生肝轉移的時間為(0.98±1.36)年，顯著短于低表達患者的(2.76±0.47)年，差異有統計學意義(t=3.552，P=0.019)。KIT高表達患者發生肝轉移的時間為(0.85±1.37)年，短于低表達患者的(2.21±1.09)年，但差異無統計學意義(t=1.997，P=0.087)。

五、影響PNETs患者生存期的單因素及多因素分析

單因素分析顯示腫瘤范圍、WHO 2010分期、AJCC7th分期及CD68、KIT、Ki-67高表達均與PNETs患者生存期有關。多因素分析顯示AJCC7th分期Ⅳ期、CD68高表達、Ki-67陽性指數>20是本組患者影響預后的獨立危險因素(表3)。

表3 79例PNETs患者生存期的單、多因素分析

注：年齡、性別、腫瘤部位未納入多因素分析

六、CD68、KIT表達與患者生存期的關系

PNETs患者的Kaplan-Meier生存曲線見圖2。CD68、KIT低表達患者生存期長于高表達者，差異均有統計學意義(P值分別為0.0002、0.0013)，CD68-/KIT-患者的生存期長于單高表達或雙高表達患者，差異有統計學意義(P值分別為0.0004、0.0057)。

圖2 CD68高低表達(2A)、KIT高低表達(2B)及不同高低表達組合(2C、2D)患者的生存曲線

PNETs為少見且具有惡性潛能的腫瘤[13-14]，但在過去的10～40年間，世界范圍內新發的PNETs以1.5～3倍的速度增長[14]。這與目前診斷技術的進步、醫師對此類疾病認知的深入有關，也與腫瘤本身發病率的增加有關。學術界認為，腫瘤并非僅由腫瘤細胞組成，而是包括成纖維、免疫、炎性、膠質等多種細胞在內的異質性混合體，亦包括附近區域的細胞間質、微血管與生物分子[6]，腫瘤微環境也調控腫瘤細胞的生物學行為。TAMs作為主要的免疫細胞，在胰腺腫瘤的發生演進中發揮重要作用。Pyonteck等[5]報道，27例PNETs內高度TAMs浸潤與腫瘤的分級分期、遠處轉移相關。Wei等[1]報道，97例無功能性PNETs的TAMs浸潤與術后復發密切相關。

CD68是重要的預測復發轉移的指標，可有效評估腫瘤復發的風險。本研究結果顯示，CD68高表達與WHO、AJCC分期密切相關，能提示肝轉移的風險及肝轉移發生時間。也是影響患者預后的獨立危險因素。

KIT是表達于胞膜的酪氨酸激酶受體，其突變與小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌等的不良預后密切相關[2,8]。在胚胎發育時期，KIT表達于胰腺組織，參與胰腺β細胞的發育與糖代謝調控[2,15]。文獻報道，KIT在胰腺導管腺癌、PNETs中表達，PNETs的KIT高表達率為8.8%～46.0%[4,8]。本研究結果顯示，PNETs的KIT高表達率為44.3%，與PNETs的分期、肝轉移風險、無功能狀態密切相關，與Son等[2]、Knoesel等[4]、Zhang等[9]的報道一致。

CD68、KIT均高表達患者更常見于鄰近器官侵犯、遠處轉移者，且與WHO 2010、AJCC7th分期密切相關。

PNETs患者缺乏特異性癥狀，在就診時或術后極易發生遠處轉移，尤其是肝轉移。本研究結果顯示，本組15例患者發生肝轉移，這些患者大多數高表達CD68、KIT，且肝轉移時間集中發生在術后10～12個月，因此建議術后以2～3個月的頻率密切隨訪患者，至少1年以上[1]。

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(本文編輯：呂芳萍)

Tumor-associated macrophages and KIT predict liver metastasis of pancreatic neuroendocrine tumors and prognosis

YeLiangtao,ZhouQuanbo,YeHuilin,ZhengShangyou,ChenRufu.

DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,ChinaCorrespondingauthor:ChenRufu,Email:RufuChen63@yahoo.com

Objective To investigate the assessed value of tumor-associated macrophages (TAMs) and KIT expression for liver metastasis in pancreatic neuroendocrine tumors (PNETs) and patients′ outcome. Methods A total of 79 patients who underwent surgical resection and pathologically diagnosed as PNETs in the Department of Hepatopancreatobiliary Surgery in Sun Yat-sen Memorial Hospital from January 1995 to May 2015 were enrolled. The immunohistochemical staining of CD68and KIT were detected and the correlations with clinicopathological factors were analyzed. Results Of 79 PNETs cases, CD68and KIT in tumor tissue were overexpressed in 30(38%) and 35(44.3%) cases, respectively. CD68overexpression was associated with tumor infiltration (P<0.001), AJCC stage 7(P< 0.001), liver metastasis (P<0.001) and early recurrence (P=0.019). Patients with low CD68level had significantly better survival than those with high CD68expression (P=0.0002). KIT overexpression was correlated with WHO 2010 and AJCC stage 7 (P<0.001;P=0.002), nonfunctional status of the tumor (P=0.002) and liver metastasis (P=0.026). The survival period of patients with low KIT expression was greatly longer than those with high KIT level (P=0.0013). CD68and KIT co-overexpression was observed in patients with tumor invasion (P<0.001),

Pancreatic neuroendocrine tumors; Macrophages; KIT; Prognosis; Neoplasm metastasis

國家自然科學基金(81370059)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.05.006

510120 廣州，中山大學孫逸仙紀念醫院膽胰外科

陳汝福，Email: RufuChen63@yahoo.com

advanced WHO and AJCC stage (bothP<0.001) and better prognostic survival (P=0.0057). Multivariate analysis showed that CD68overexpression (HR: 2.9; 95%CI: 1.16～7.23;P=0.033) was an independent prognostic factor for PNETs. Conclusions CD68and KIT overexpression is correlated with advanced disease stage, higher risk for liver metastasis and worse survival. CD68is an independent prognostic factor for PNETs.

2016-01-25)