延靈丹方對卵巢早衰小鼠激素水平及凋亡調控蛋白Bcl-2/Bax表達的影響

王 洋 王 濱 李鵬輝 郎尉雅

1.齊齊哈爾醫學院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫學院生物遺傳教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫學院組胚教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

延靈丹方對卵巢早衰小鼠激素水平及凋亡調控蛋白Bcl-2/Bax表達的影響

王 洋1王 濱1李鵬輝2郎尉雅3

1.齊齊哈爾醫學院生理教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫學院生物遺傳教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.齊齊哈爾醫學院組胚教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

目的探討延靈丹方對小鼠卵巢早衰（POF）模型激素水平及凋亡調節基因B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（Bc1-2）、Bc1-2相關X蛋白（Bax）表達的影響。方法將40只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為4組，包括空白組、模型組、延靈丹方組、西藥組。除空白組外，其余各組建立免疫性POF小鼠模型。延靈丹方組給予延靈丹藥液灌胃，西藥組給予戊酸雌二醇灌胃，空白組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，各組均為2次/d，連續15 d。運用酶聯免疫吸附測定實驗檢測小鼠血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）水平；Western b1ot法檢測卵巢組織Bc1-2、Bax蛋白的表達。結果與空白組比較，模型組小鼠血清E2水平降低，血清FSH水平升高（P＜0.01），血清LH水平有一定程度升高（P＜0.05）；與模型組比較，延靈丹方組及西藥組小鼠血清E2水平均升高，FSH、LH水平均降低（P＜0.01）。與空白組比較，模型組小鼠卵巢Bc1-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加（P＜0.01），且Bc1-2/Bax下降（P＜0.01）；與模型組比較，延靈丹方組及西藥組小鼠卵巢Bc1-2蛋白表達顯著增加，Bax蛋白表達減少（P＜0.01），Bc1-2/Bax明顯上升（P＜0.01）。結論延靈丹方通過下調卵泡及卵巢間質Bax蛋白的表達，上調Bc1-2蛋白的表達，抑制卵巢顆粒細胞的過度凋亡，調節卵巢激素水平，改善卵巢功能。

延靈丹方；卵巢早衰；性激素；Bcl-2；Bax；顆粒細胞；凋亡

月經初潮年齡正?；蚯啻浩谘舆t，第二性征發育正常的女性，在40歲之前閉經伴血清促性腺激素水平升高和雌激素水平下降則為卵巢早衰（premature ovarian fai1ure）。該病可出現圍絕經期綜合征癥狀、不孕癥，增加罹患骨質疏松和抑郁癥的風險，并可導致不同程度的認知功能障礙及神經系統疾病，近年來其發病率逐年上升［1-2］。研究發現，各種原因導致的卵巢早衰大都伴隨著卵巢顆粒細胞的凋亡，因此卵巢顆粒細胞的凋亡可能成為卵巢早衰發病的始動因素［3-4］。中藥復方制劑——延靈丹在治療卵巢早衰排卵障礙和生殖內分泌紊亂方面取得了良好的臨床療效［5］。但是關于延靈丹對卵巢顆粒細胞凋亡的影響尚鮮見報道。本課題擬觀察延靈丹方對卵巢早衰模型小鼠激素水平的調節及對卵巢顆粒細胞凋亡調控Bc1-2、Bax蛋白表達的影響，探討延靈丹方對免疫性卵巢早衰模型小鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

40只7～8周SPF級健康雌性BALB/c小鼠，由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供［合格證號SCXK（黑）2015-0004］，飼養于齊齊哈爾醫學院清潔級實驗動物中心，室溫維持在25℃，濕度60%～70%，通風良好。

1.2 試劑

中藥飲片購自齊齊哈爾市中醫醫院中藥局；戊酸雌二醇片購自德國拜耳醫藥有限公司，批號J20150012；小鼠透明帶多肽溶液購自天津森潤生物技術有限公司，批號P00102；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自上海偉進生物科技有限公司，批號F5884、F5502；小鼠血清雌二醇（E2）、小鼠促黃體生成激素（LH）和小鼠促卵泡生成激素（FSH）的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海酶聯生物有限公司，批號20150624。

1.3 儀器

MP-120-2型電子天平（上海第二天平儀器廠）；BX53光學顯微鏡（日本奧林帕斯公司）；RM2235冰凍切片機（德國Lecai公司）；Mu1tiskan MK3酶標儀（芬蘭Thermo公司）。

1.4 藥物配制

1.4.1 中藥配制水煎地黃12 g、菟絲子12 g、杜仲12 g、山芋12 g、山藥12 g、黨參6 g、黃芪6 g、首烏6 g、黑蟻6 g、枸杞子6 g、牡蠣6 g、丹參6 g、香附6 g、甘草3 g，并濃縮至2倍臨床等效劑量1.08 g/mL的無菌藥液，4℃冰箱保存。

1.4.2 西藥配制三蒸水溶解戊酸雌二醇片，濃度為0.006 mg/mL。

1.5 動物模型及實驗分組

取6 mg ZP3透明多肽粉末，加入6 mL雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按1∶1配制成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按1∶1配成免疫強化試劑。每日上午9：00，每只小鼠給予0.15 mL免疫試劑注射雙后腳掌處及腹腔皮下，14 d后以免疫強化試劑0.15 mL再次注射雙后腳掌處及腹腔皮下加強免疫，建立免疫性卵巢早衰模型［6］。

將40只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為空白組、模型組、延靈丹方組、西藥組，每組10只。除空白組外，其余各組建立免疫性卵巢早衰小鼠模型，空白組造模時每只小鼠予0.15 mL生理鹽水注射雙后腳掌及腹腔皮下。延靈丹方組給予2倍臨床等效劑量（1.08 mL/20 g）延靈丹方藥液灌胃，西藥組給予0.4 mL/ 20 g戊酸雌二醇進行灌胃，空白組、模型組給予等量生理鹽水進行灌胃。各組均為2次/d，連續15 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 小鼠臟器指數及卵巢組織形態學觀察各組小鼠于灌胃結束后第2天，摘取眼球取血后處死，計算卵巢的臟器指數=臟器重量/體重。隨后將1/2卵巢組織迅速用液氮保存用于Western b1ot等實驗。另外1/2卵巢以4%多聚甲醛固定4～6 h，石蠟切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.6.2 血清學檢測小鼠眼球取血，離心4000 r/min，10 min，分離血清，采用ELISA法，按照試劑盒使用說明操作檢測血清中E2、FSH、LH的含量。

1.6.3 Western blot檢測卵巢中Bcl-2堯Bax蛋白表達取每組小鼠卵巢組織20 g，冰上提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度后確定蛋白上樣量，進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉至PVDF膜，以3%脫脂奶粉封閉1 h，再分別添加兔抗小鼠Bc1-2抗體（1∶500），兔抗小鼠Bax抗體（1∶100）和兔抗小鼠β-actin抗體（1∶300），37℃孵育2 h，洗膜后，加HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶500），37℃孵育1 h。2 h后用超敏發光液顯影、定影，Image-Pro P1us6.0.1軟件測定各組蛋白條帶吸光度值，以β-actin作為內參照，將各組條帶與β-actin的比值作為蛋白表達水平。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件對本實驗數據進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠卵巢大體解剖及染色光鏡下組織形態觀察

大體觀察小鼠卵巢組織，空白組卵巢形態正常，顏色潤澤；模型組小鼠雙側卵巢不同程度萎縮，色蒼白。HE染色發現，空白組卵巢內見各級發育卵泡及其黃體組織，且卵母細胞體積較大，顆粒細胞數量多，閉鎖卵泡較少；模型組卵巢內幾乎不見成熟卵泡，閉鎖卵泡數量增加，顆粒細胞數量明顯減少。西藥組和延靈丹方組卵巢組織間質少，黃體較多，可見大量原始卵泡和初級卵泡、次級卵泡及接近成熟的卵泡，顆粒細胞數量較模型組增多。見圖1。

圖1 各組小鼠卵巢組織形態學病理切片（HE染色，100×）

2.2 各組小鼠血清性激素水平及臟器指數變化情況

與空白組比較，模型組小鼠血清E2水平降低，血清FSH水平升高，差異有高度統計學意義（P＜0.01），血清LH水平有一定程度升高，差異有統計學意義（P＜0.05），提示造模成功；與模型組比較，西藥組、延靈丹方組小鼠血清E2水平有所上升，FSH、LH水平均有所下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。與空白組比較，模型組的卵巢指數顯著降低（P＜0.01），提示小鼠卵巢萎縮；與模型組比較，西藥組及延靈丹方組卵巢指數有所上升（P＜0.05），提示藥物使小鼠卵巢質量得到改善。見表1。

表1 各組小鼠血清E2、FSH、LH含量測定及卵巢指數比較（，n=10）

表1 各組小鼠血清E2、FSH、LH含量測定及卵巢指數比較（，n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；E2：雌二醇；FSH：卵泡刺激素；LH：促黃體生成素

組別卵巢指數E2（Pg/mL）FSH（mU/mL）LH（mU/mL）空白組模型組西藥組延靈丹方組F值P值0.081±0.011 0.052±0.007**0.064±0.013#0.066±0.012#10.85＜0.01 119.60±21.60 61.20±10.35**96.45±20.78##104.11±20.96##16.91＜0.01 3.89±1.43 5.82±1.08**4.20±0.85##3.90±1.19##6.37＜0.01 3.85±1.11 5.52±1.08*4.14±1.06##3.93±1.01##5.40＜0.01

2.3 各組小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表達

與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織Bc1-2蛋白表達減少，而Bax蛋白表達增加（P＜0.01），且模型組小鼠卵巢Bc1-2/Bax顯著下降，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；提示卵巢Bax蛋白上調，Bc1-2蛋白下調可能加速卵巢顆粒細胞凋亡，導致卵泡閉鎖，發生卵巢早衰。與模型組比較，延靈丹方組及西藥組小鼠卵巢Bc1-2蛋白表達顯著增加，Bax蛋白表達減少（P＜0.01），且Bc1-2/Bax明顯上升，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2、圖2～3。

表2 各組小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表達（，n=10）

表2 各組小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表達（，n=10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別Bc1-2BaxBc1-2/Bax空白組模型組西藥組延靈丹方組F值P值0.46±0.01 0.30±0.02**0.43±0.02##0.44±0.03##117.59＜0.01 0.27±0.02 0.47±0.01**0.29±0.03##0.30±0.03##148.84＜0.01 1.78±0.23 0.61±0.09**1.69±0.07##1.63±0.10##136.12＜0.01

圖2 小鼠卵巢Bcl-2蛋白的表達

圖3 小鼠卵巢Bax蛋白的表達

3 討論

祖國醫學認為卵巢早衰屬“閉經”“血枯”“不孕癥”“血隔”的范疇。中醫學卵巢早衰病因病機主要是腎陰虧虛［7］，延靈丹方以補腎填精、養血益氣、調理沖任為立方大法。方中用地黃、菟絲子、山芋、山藥、杜仲、首烏、枸杞子養陰生水填精，為方中主藥。地黃可“補腎水真陰不足”；菟絲子為治療女子腎精虧虛的要藥；枸杞能“補肝經之陰，益腎水之陽”，所謂補陰稍佐以補陽之藥，陽中求陰；首烏與諸藥相配，固澀精氣，使腎氣得固，精有所藏。在補腎填精的同時，方中又以黑蟻、丹參、黨參、黃芪等養血益氣；香附養氣以行血；牡蠣“為肝腎血分之要藥”［8-9］?？v觀全方配伍，以補腎滋水為主，使精足而天癸充盛，再養血行氣使精充血足，經血有其物質基礎，營血充盛，陰可制陽，五志七情調暢，諸證可解。

女性的卵母細胞儲備數量從出生開始就已確定，在女性整個生命周期中只有400～500個卵泡可發育成熟并排卵［10］。在早期卵泡閉鎖過程中，卵母細胞首先開始凋亡，卵泡細胞顆粒由內層向外層逐漸凋亡；而對于生長晚期的卵泡，則是顆粒細胞首先凋亡，誘導卵母細胞凋亡，觸發卵泡閉鎖［11-12］。卵巢的顆粒細胞分泌的雌激素對維持女性生理活動有重要作用，故顆粒細胞凋亡誘發卵巢早衰，已成為目前公認的首要發病因素。凋亡是由相關性基因調控完成的細胞主動性死亡的過程，眾多研究認為，對卵巢顆粒細胞凋亡起主要作用的基因有Bc1-2、Bax。Bc1-2是人體的長壽基因之一，也是目前研究較多的一種抑制細胞凋亡的基因［13］。Bc1-2基因可抑制顆粒細胞凋亡，促進其分裂，降低卵泡的閉鎖率［14］；若卵巢中缺少Bc1-2基因，則有效卵泡減少，乃至出現無卵母細胞的卵泡［15］。Bax基因與Bc1-2基因同源且相互拮抗，研究顯示Bax蛋白過度表達是卵子細胞死亡的關鍵因素［16］。若Bc1-2＜Bax，則細胞趨向凋亡；若Bc1-2＞Bax，則細胞趨向成活［17-18］。

透明帶抗原免疫可使卵巢閉鎖卵泡增加，局部免疫調節功能紊亂，導致顆粒細胞凋亡加速，分泌雌激素能力下降，發生卵巢功能早衰［19-20］。本研究在通過透明帶多抗為免疫原建立卵巢早衰模型小鼠基礎上，觀察中藥復方延靈丹對卵巢早衰模型小鼠血清激素水平的影響，證實了延靈丹方的治療效果；進一步觀察結果顯示，延靈丹方和戊酸雌二酮均能夠上調Bc1-2蛋白表達水平，下調Bax蛋白表達水平，進而使Bc1-2/ Bax比例升高，抑制卵巢顆粒細胞的過度凋亡，減少卵泡閉鎖，改善卵巢功能，促進卵巢早衰的逆轉。由于中藥復方制劑屬于多靶點藥物，是否存在其他作用機制，在今后的研究中需進一步探索。

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Influence of Yanlingdan PrescriPtion on the levels of sex hormone and ex-Pression of aPoPtosis adjusted Protein Bcl-2/Bax in mice with Premature ovarian failure

WANG Yang1WANG Bin1LI Penghui2LANG Weiya3
1.Staff Room of Physio1ogy，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China；2.Staff Room of Biogenetics，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China；3.Staff Room of Histoembryo1ogy，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China

Objective To investigate the effect of Yan1ingdan Prescription on the 1eve1s of sex hormone and expression of B-ce11 1ymphoma/1eukemia-2（Bc1-2）and Bc1-2 associated X protein（Bax）in mice mode1 with premature ovarian fai1ure（POF）.Methods Forty SPF BALB/c fema1e mice were random1y divided into b1ank group，mode1 group，Yan-1ingdan Prescription group and western medicine group.Autoimmune POF mice mode1 were set up except b1ank group. Yan1ingdan Prescription group was given Yan1ingdan Prescription by gavage，western medicine group was given estradio1 va1erate by gavage，b1ank group and mode1 group were given equiva1ent norma1 sa1ine by gavage，twice a day for 15 days.The serum 1eve1s of estradio1（E2），fo11ic1e-stimu1ating（FSH），1utropin（LH）were detected by the enzyme-1inked immunosorbent assay（ELISA）method.The expression of Bc1-2 and Bax protein in mice ovarian tissue was detected by Western b1ot method.Results Compared with the b1ank group，the serum 1eve1 of E2was decreased，FSH was increased in mode1 group，with high1y statistica11y significant differences（P＜0.01），meanwhi1e，the 1eve1 of LH was increased to a certain extent，with statistica11y significant difference（P＜0.05）；compared with the mode1 group，the serum 1eve1s of E2in western medicine group and Yan1ingdan Prescription group were increased，the 1eve1s of FSH and LH were decreased significant1y（P＜0.01）.Compared with the b1ank group，the expression of Bc1-2 protein in mode1 group was decreased significant1y，and the expression of Bax protein was increased significant1y（P＜0.01），and Bc1-2/ Bax ratio of mode1 group was decreased significant1y（P＜0.01）；compared with the mode1 group，the expression ofBc1-2 protein in Yan1ingdan Prescription group and western medicine group were increased obvious1y，the expression of Bax protein were decreased（P＜0.01），and the Bc1-2/Bax ratio was increased significant1y（P＜0.01）.Conclusion Through down-regu1ating the expression of Bax in fo11ic1e and ovarian stroma and up-regu1ating the expression of Bc1-2，Yan-1ingdan Prescription can inhibit the excessive apoptosis of granu1ar ce11s，regu1ate the sex hormone 1eve1s，and improve the function of ovaries.

Yan1ingdan Prescription；Premature ovarian fai1ure；Sex hormone；Bc1-2；Bax；Granu1ar ce11；Apoptosis

R711.75

A

1673-7210（2016）07（c）-0042-04

2016-03-25本文編輯：張瑜杰）

黑龍江省齊齊哈爾市科學技術計劃項目（SFGG-201510、SFGG-201565）。

王洋（1983.8-），女，碩士研究生；研究方向：生殖與內分泌。