雷利度胺聯合地塞米松抗T淋巴瘤細胞作用的研究

李紅玲 陳 彤 李明玉 張旭霞 齊發梅 王 芳

1.甘肅省人民醫院腫瘤內科，甘肅蘭州730000；2.甘肅省人民醫院檢驗中心，甘肅蘭州730000

雷利度胺聯合地塞米松抗T淋巴瘤細胞作用的研究

李紅玲1陳 彤1李明玉1張旭霞1齊發梅2王 芳2

1.甘肅省人民醫院腫瘤內科，甘肅蘭州730000；2.甘肅省人民醫院檢驗中心，甘肅蘭州730000

目的探討雷利度胺聯合地塞米松對T淋巴瘤細胞增殖與凋亡的影響。方法預實驗后選取雷利度胺（40、80、120、160、200、400、600 mg/L）、地塞米松（50、100、150、200、250 mg/L）及兩藥聯用處理人T淋巴瘤Jurkat細胞24、48、72 h；MTT法測試細胞毒性，流式細胞術檢測細胞周期，光鏡、熒光顯微鏡進行形態學觀察，Annexin V染色檢測凋亡率。結果雷利度胺和地塞米松均以濃度和時間依賴性方式抑制Jurkat細胞生長，誘導Jurkat細胞凋亡。雷利度胺和地塞米松聯合處理組的Jurkat細胞增殖受抑率顯著高于單用雷利度胺組（P＜0.05）和單用地塞米松處理組（P＜0.05）。結論雷利度胺和地塞米松聯合具有協同抗T細胞淋巴瘤作用，本研究為雷利度胺和地塞米松臨床聯合應用于T細胞淋巴瘤提供了理論基礎。

雷利度胺；地塞米松；T淋巴瘤細胞；增殖；凋亡

淋巴瘤是血液系統惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤（HD）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）兩大類，以NHL更為多見［1］，其中NHL占淋巴瘤總數的90%，不同亞類之間惡性程度、療效、預后有很大差異［2］。常用的治療方法包括化療、干細胞移植、靶向治療等［3］，但由于耐藥、復發等因素，仍有部分患者不能得到治愈，因此有必要尋找新的治療手段。

雷利度胺（Lena1idomide）是沙利度胺的類似物，研究證實雷利度胺對部分NHL亞型及其他類型實體瘤有效，如用于T細胞淋巴瘤的治療［4］。目前雷利度胺在其他類型淋巴瘤中的作用研究仍是熱點。在骨髓瘤治療中雷利度胺臨床常用的方案是與地塞米松聯合，但在淋巴瘤中二者聯合是否有協同作用尚不明確。本研究對雷利度胺聯合地塞米松對T細胞淋巴瘤細胞的抗腫瘤作用進行探討，旨在為雷利度胺用于T細胞淋巴瘤治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雷利度胺購自臺州市椒江星成醫藥化工有限公司，用DMSO配制成20 mg/mL的儲存液。地塞米松磷酸鈉注射液購自辰欣藥業股份有限公司，原液濃度5 mg/mL作為儲備液。二者均-20℃凍存，臨用時稀釋至工作濃度。其中，DMSO的使用濃度低于1%。Hoechst33258、Annexin V試劑盒為杭州碧云天公司產品。

1.2 細胞培養、形態學觀察

本研究采用的細胞系為人T淋巴瘤細胞株Jurkat，購自中國科學院上海細胞庫。用RPMI1640完全培養液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫孵箱中培養。所有細胞系分別以（2～3）×105/mL個細胞的起始濃度接種于含或不含相應藥物的新鮮RPMI1640培養液（內含10%小牛血清和1%青、鏈霉素）中。實驗選用對數生長期細胞。藥物處理的細胞，經離心、涂片、Wright's染色后在光鏡下觀察其細胞形態學。

1.3 MTT比色法檢測細胞毒作用

在預實驗中發現低濃度雷利度胺（1.25、2.5、5、10、20 mg/L）對Jurkat細胞無明顯抑制作用，故本研究中選擇雷利度胺濃度為40、80、120、160、200、400、600 mg/L。各組均按每孔3×104個細胞數接種96孔板，每組設3復孔。分別于轉染后24，48，72 h測定570 nm處吸光度值A570。細胞抑制率=（1-A570處理組/A570未處理組）×100%。地塞米松劑量選擇50、100、150、200、250 mg/L，檢測方法同上。

1.4 細胞周期檢測

收集不同處理后Jurkat細胞，PBS洗滌后，70%乙醇固定，4℃冰箱過夜。檢測前PBS沖洗細胞1次，調整樣品濃度至1×106/mL，加入碘化丙啶染色液，4℃冰箱中避光染色30 min，流式細胞術分析細胞周期。

1.5 細胞凋亡檢測

1.5.1 光鏡下檢測Jurkat細胞凋亡形態學變化采用瑞氏吉姆薩染色，熒光顯微鏡檢測Jurkat細胞凋亡按Hoechst33258說明書進行熒光染色，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率分別取對照組及各實驗組細胞1×106個，用PBS洗滌2次，加入490 μL結合緩沖液，充分混勻細胞，加入5μL FITC標記AnnexinV和15 μL溶解的碘化丙錠于細胞懸液中，輕輕混勻，將試管置于4℃避光孵育10 min，流式細胞儀檢測凋亡細胞比例。

1.6 MTT及Annexin V檢測雷利度胺聯合地塞米松對Jurkat細胞增殖及凋亡的作用

實驗分組：對照組、雷利度胺組（200 mg/L）、地塞米松組（250 mg/L）、雷利度胺（200 mg/L）聯合地塞米松組（250 mg/L），以上均為終濃度。調整各組細胞數為5×103個/孔，置37℃、5%CO2培養箱中繼續培養48 h，MTT法檢測細胞毒作用，Annexin V-FITC/PI檢測凋亡率。采用金正均法［5］計算雷利度胺和地塞米松聯合應用在促進凋亡方面是否有協同作用；q=Ea+b/（Ea+Eb-Ea×Eb）；Ea+b為聯合用藥組的細胞凋亡率；Ea、Eb分別為應用a藥和b單獨處理組的細胞凋亡率。q值在0.85～1.15之間為兩藥聯合作用單純相加，q值＜0.85為兩藥合用有拮抗作用，q值＞1.15為兩藥合用有協同作用。

1.7 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外實驗檢測單用雷利度胺對Jurkat細胞增殖的抑制作用

預實驗發現雷利度胺劑量低于40 mg/L時難以檢測到顯著的細胞抑制作用，低濃度雷利度胺（1.25、2.5、5、10、20 mg/L）的細胞抑制率與對照組比較差異無統計學意義。本研究以40 mg/L為起始劑量，發現劑量增加后雷利度胺細胞抑制率逐漸增加，40、80、120、160、200、400、600 mg/L雷利度胺對Jurkat細胞增殖均有抑制作用，呈時間和劑量依賴性。200 mg/L雷利度胺作用Jurkat細胞24、48、72 h后，細胞增殖抑制率分別為18.2%、27.7%、31.8%。但這種抑制作用總體上較弱，因為雷利度胺劑量即使達到600 mg/L作用72 h，抑制率僅為39.1%，仍未達到IC50。見圖1。

圖1 MTT法檢測雷利度胺對Jurkat細胞增殖能力的影響

2.2 體外實驗檢測單用地塞米松對Jurkat細胞增殖的抑制作用

預實驗結果顯示，較低濃度地塞米松對Jurkat細胞增殖的抑制作用微弱，劑量低于50 mg/L時難以檢測到顯著的細胞抑制作用，故本研究中選擇≥50 mg/L的濃度進行后續實驗。結果顯示，50、100、150、200、250 mg/L地塞米松對Jurkat細胞增殖均有抑制作用，呈時間和劑量依賴性。見圖2。

圖2 MTT法檢測地塞米松對Jurkat細胞增殖能力的影響

2.3 體外實驗檢測單用雷利度胺對Jurkat細胞周期的影響

用200 mg/L雷利度胺作用Jurkat細胞48 h后，G0/G1、S和G2/M期細胞比例分別為（29.4±2.5）%、（8.42± 1.1）%、（62.2±3.2）%，與對照組［（29.2±1.8）%、（8.12± 0.8）%、（62.7±4.4）%］相比，差異無統計學意義（P＞0.05），說明200 mg/L雷利度胺作用48 h對Jurkat細胞周期無顯著影響。見圖3。

2.4 光鏡、Hoechst33258染色檢測單用雷利度胺對Jurkat細胞凋亡的影響

2.4.1 光鏡檢測Jurkat細胞凋亡形態學變化光鏡下顯示，對照組細胞胞體圓形或近圓形，細胞膜有少量突起，胞膜完整，胞漿豐富，呈藍色或淡藍色，細胞核較大，呈圓形或近圓形，細胞核膜完整。與對照組相比，雷利度胺處理組出現細胞變形，胞膜不完整，胞漿丟失，細胞核碎裂等凋亡改變，并出現凋亡小體。見圖4。

2.4.2 Hoechst33258染色熒光顯微鏡檢測Jurkat細胞凋亡形態學變化在熒光顯微鏡下，對照組Jurkat細胞形態完整，染色均勻一致，Hoechst 33258熒光染色檢測結果顯示，對照組的細胞核大小均一，形態完整，較圓，核內熒光均勻彌散，呈藍色淡染。雷利度胺處理后，Jurkat細胞呈現典型的凋亡改變，出現部分細胞凋亡變化，細胞核體積縮小，有核碎裂現象，可見染色質高度濃集、核染色質凝聚成明亮的團塊狀等改變。見圖5，封三。

2.5 MTT檢測雷利度胺聯合地塞米松對Jurkat細胞生長的抑制作用

200 mg/L雷利度胺與250 mg/L地塞米松聯合作用24、48、72 h對Jurkat細胞生長抑制率顯著高于單用雷利度胺組（P＜0.05）和單用地塞米松組（P＜ 0.05）。見表1。

圖3 流式細胞術檢測單用雷利度胺對Jurkat細胞周期的影響

圖4 光鏡觀察雷利度胺誘導凋亡的形態學改變（100×）

2.6 Annexin V染色檢測雷利度胺聯合地塞米松對Ju鄄rkat細胞凋亡的誘導作用

流式細胞術檢測分析顯示，200 mg/L雷利度胺與250 mg/L地塞米松聯合作用48 h細胞凋亡率顯著高于單用雷利度胺組和單用地塞米松組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。本研究中通過金正均法計算出q=1.21，說明雷利度胺和地塞米松聯合應用在促進凋亡方面有協同作用。

表1 雷利度胺與地塞米松聯合應用對Jurkat細胞的增殖抑制作用（%，n=4）

圖6 流式細胞術檢測雷利度胺聯合地塞米松對Jurkat細胞凋亡的影響

3 討論

雷利度胺是沙利度胺的衍生物，其研發主要是基于減少沙利度胺的不安全性。2000年后，雷利度胺顯著的抗腫瘤作用［6］成為研究熱點，2006年被相關組織批準用于多發性骨髓瘤的治療，其治療方案為雷利度胺與地塞米松聯合應用［5］。骨髓增生異常綜合征的亞型5q-綜合征也是其治療的適應證之一［7］。

隨著對雷利度胺抗腫瘤作用的研究，發現其對某些淋巴瘤如T細胞淋巴瘤也有一定臨床效果［8］，在濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的臨床應用中也有一定的臨床反應［9］。但其對T細胞淋巴瘤的作用及與地塞米松的聯合作用研究較少，機制仍不明確。本研究選擇T細胞淋巴瘤細胞株Jurkat作為研究對象，探討雷利度胺聯合地塞米松對T淋巴瘤細胞增殖與凋亡的影響。雷利度胺、地塞米松及兩藥聯用處理人淋巴瘤Jurkat細胞24、48、72 h，MTT法測試細胞毒性，光鏡下及熒光顯微鏡進行形態學觀察。結果提示，雷利度胺以濃度和時間依賴性方式抑制Jurkat細胞生長及誘導細胞凋亡。在熒光顯微鏡下，雷利度胺處理48 h后，可見核染色質凝聚成明亮的團塊狀，部分細胞形態不規則，并有核碎裂現象，提示Jurkat細胞呈現典型的凋亡改變。經流式細胞術Annexin V分析顯示，雷利度胺對T細胞淋巴瘤也有抗增殖與誘導凋亡作用，與其他腫瘤中的研究結果一致。Mitsiades等［10］研究發現，雷利度胺抗骨髓瘤細胞增殖和誘導凋亡作用與其抑制NF-κb的活性有關。

在預實驗中發現，劑量低于40 mg/L時難以檢測到雷利度胺顯著的細胞抑制作用，增大劑量后，在40～600 mg/L劑量區間，其增殖抑制率和凋亡率均顯著低于常用的化療藥物的相應數值，說明與常用化療藥物相比，雷利度胺的抗增殖和誘導凋亡作用較弱，推測其發揮抗腫瘤作用的機制可能更多的與免疫調控、抗血管生成［11］等相關。研究表明，雷利度胺作為一個多效免疫調節劑可殺傷腫瘤細胞，也可增強對腫瘤細胞的免疫應答［12-15］。雷利度胺通過上調CDK抑制劑p21 waf-1引起濃度依賴的細胞周期停滯在G0/G1期，并下調促存活的活性激酶ERK1/2和Akt的活性發揮抗腫瘤作用［16-17］。基于以上分析，認為雷利度胺抗Jurkat細胞增殖和誘導凋亡可能是其抗腫瘤作用機制之一。

地塞米松是一種皮質類固醇藥物，常用于腫瘤的化療，尤其是在多發性骨髓瘤中地塞米松常單獨或與其他化療藥物聯合應用［18］，但雷利度胺與地塞米松聯合應用是否也適用于淋巴瘤尚不明確。本研究選擇雷利度胺與地塞米松聯合應用，觀察對淋巴瘤細胞增殖和凋亡的影響，旨在為臨床二者的聯合應用提供理論基礎。

本研究結果發現，雷利度胺和地塞米松聯合處理組Jurkat細胞增殖受抑率顯著高于單用雷利度胺組（P＜0.05）和單用地塞米松處理組（P＜0.05）。在凋亡誘導方面，流式細胞術檢測分析顯示，200 mg/L雷利度胺與250 mg/L地塞米松聯合作用48 h細胞凋亡率顯著高于單用雷利度胺組和單用地塞米松組，經統計學分析，差異均有顯著性（P＜0.05）。為了解雷利度和地塞米松聯合應用在促進凋亡方面是否有協同作用，通過金正均法計算出q=1.21，提示雷利度胺與地塞米松聯合應用具有協同作用。

綜上所述，雷利度胺具有抗T細胞淋巴瘤作用，其作用機制可能與其抗淋巴瘤細胞增殖和誘導凋亡有關，雷利度胺和地塞米松聯合具有協同作用。本研究為臨床雷利度胺和地塞米松聯合應用于T細胞淋巴瘤治療提供了一定理論基礎。

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Combination effects of Lenalidomide and Dexamethasone on inhibition of T lymPhoma cells

LI Hongling1CHEN Tong1LI Mingyu1ZHANG Xuxia1QI Famei2WANG Fang2
1.Department of Onco1ogy，Peop1e's Hospita1 of Gansu Province，Lanzhou730000，China；2.Department of C1inica1 Laboratory，Peop1e's Hospita1 of Gansu Province，Lanzhou730000，China

Objective To study the effect of combination of Lena1idomide and Dexamethasone（DEX）on the T 1ymphoma ce11s growth and apoptosis.Methods After the pre1iminary experiment，Lena1idomide（40，80，120，160，200，400，600 mg/L）and Dexamethasone（50，100，150，200，250 mg/L），and the combination of these two drugs were used to treat Jurkat 1ymphoma ce11s for 24，48 or 72 hours.MTT was used to eva1uate the cytotoxic effects.F1ow cytometry was used to detect ce11 cyc1e.Ce11u1ar morpho1ogic changes of apoptotic ce11 nuc1eus were observed using the Hoechst 33258 staining.The percentage of apoptosis ce11s was detected by f1ow cytometry using Annexin V-FITC/PI Apoptosis assay.Results Both Lena1idomide and Dexamethasone cou1d inhibit the ce11s pro1iferation and induce the apoptosis of Jurkat ce11s in a dose and time dependent manner.There was a significant increase of the ce11 inhibitory rate after exposure to combination of Lena1idomide and Dexamethasone compared to Lena1idomide a1one（P＜0.05）or Dexamethasone a1one（P＜0.05）.Conclusion Combination of Lena1idomide and Dexamethasone has synergistic activity in inhibition of T 1ymphoma ce11s.This study，therefore，provides the framework for c1inica1 eva1uation of Lena1idomide combined with Dexamethasone to improve patients'outcome in T 1ymphoma.

Lena1idomide；Dexamethasone；T 1ymphoma ce11s；Pro1iferation；Apoptosis

R285

A

1673-7210（2016）07（c）-0008-05

2016-04-24本文編輯：程銘）

國家自然科學基金資助項目（30960438；81260 342）；甘肅省蘭州市科技發展計劃項目（2009-1-56）。

李紅玲（1969.12-），女，甘肅蘭州人，博士，碩士生導師，主任醫師，主要從事惡性腫瘤藥物治療研究工作。