黑水纈草提取物對阿爾茨海默病模型小鼠治療作用的代謝組學研究

王 喆 李 偉 李菁媛 李 琳 李乃靜

1.中國醫科大學附屬盛京醫院干診科，遼寧沈陽110016；2.沈陽藥科大學藥物分析教研室，遼寧沈陽110016

黑水纈草提取物對阿爾茨海默病模型小鼠治療作用的代謝組學研究

王 喆1李 偉2李菁媛1李 琳1李乃靜1

1.中國醫科大學附屬盛京醫院干診科，遼寧沈陽110016；2.沈陽藥科大學藥物分析教研室，遼寧沈陽110016

目的運用超高效液相色譜-質譜聯用技術（UPLC-MS）探討黑水纈草提取物對阿爾茨海默病（AD）的治療機制。方法將雄性昆明小鼠分為3組，分別為對照組（2%吐溫80）、AD模型組（2%吐溫80）和治療組（95%黑水纈草粗提物2 g/kg），灌胃給藥30 d。運用Morris水迷宮實驗和UPLC-MS技術對小鼠進行研究。結果Morris水迷宮定位航行實驗顯示，與對照組比較，AD模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），治療組小鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。空間探索實驗顯示，與對照組比較，AD模型組小鼠單位時間目標象限停留時間短，穿臺次數減少（P＜0.05），治療組小鼠單位時間內目標象限停留時間長，穿臺次數增加（P＜0.05）。通過UPLC-MS/MS技術，確定了10種AD的血漿生物標志物，分別為組氨酸、溶血磷脂酰膽堿C16∶0、溶血磷脂酰膽堿C18∶2、溶血磷脂酰膽堿C18∶1、溶血磷脂酰膽堿C20∶4、溶血磷脂酰膽堿C22∶6、十六碳鞘磷脂、二氫神經鞘氨醇、4-羥雙氫（神經）鞘氨醇C18、4-羥雙氫（神經）鞘氨醇C20，與對照組比較，AD模型組小鼠血漿中10種標志物的含量均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。治療組小鼠血漿中10種標志物的含量均明顯上升（P＜0.05或P＜0.01）。結論黑水纈草提取物可提高AD小鼠的認知功能，其作用機制與氨基酸、磷脂和鞘脂代謝等相關代謝通路有關。

阿爾茨海默病；黑水纈草；代謝組學；生物標志物

阿爾茨海默病（AD）是一種起病隱匿的中樞神經系統受損性疾病，是最常見的癡呆類型［1］。隨著人口老齡化，AD已成為致老年人死亡的第四大疾病［2］。黑水纈草（Valeriana amurensis）為敗醬科纈草屬植物，具有鎮靜、抗抑郁及抗心血管疾病等作用［3］，有研究表明黑水纈草具有治療AD的功效［4］。本研究運用代謝組學技術研究黑水纈草提取物對AD的調控機制，為AD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

黑水纈草由安國市瑞泰堂藥材行提供；Aβ25～35由美國Sigma公司生產；色譜乙腈、色譜甲醇，購于美國J.T.Baker公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機有限公司，離心腔直徑250 mm）；儀器為液相系統Waters AcquityTMU1tra Performance Liquid Chromatography（UPLC）System，質譜儀Micromass Quattro microTMAPI三重四級桿質譜儀，美國Waters公司。

1.2 實驗動物

12周雄性KM小鼠24只，體重18～22 g，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，動物合格證號［SCXK（遼）2010-0001］。置于室溫（25±2）℃，12/12 h晝夜循環光照條件下生活，自由攝食、飲水。

1.3 黑水纈草提取物制備

將500 g干燥的黑水纈草根及根莖粉碎成粗粉，以10倍體積的95%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，濾過，回收乙醇液，減壓濃縮，得150 g乙醇提取物，即黑水纈草95%粗提物。

1.4 AD模型制備

實驗小鼠適應性喂養1周，運用完全隨機方法，分為對照組、AD模型組和治療組，每組8只。采用小鼠雙側側腦室注射Aβ25～35蛋白的方法制備AD模型。小鼠麻醉后，雙側側腦室（以前囟為起點，沿矢狀縫后移0.5 mm，然后側移1.1 mm，垂直進針3.0 mm）各緩慢注射3 μL聚合態Aβ25～35溶液，對照組雙側側腦室注射等量生理鹽水。

1.5 給藥方法

造模后第3天開始灌胃，治療組小鼠給予95%黑水纈草粗提物（用2%吐溫80溶液做溶劑配成0.1 g/mL溶液）2 g/kg，AD模型組和對照組給予等量的2%吐溫80溶液。每日1次，實驗進行30 d。

1.6 Morris水迷宮

實驗進行6 d，期間小鼠正常灌胃給藥。前5 d進行定位航行實驗，每日2次，觀察小鼠的運動軌跡，若60 s內小鼠未尋到平臺，則將其引導致平臺，并在上面停留10 s。第6天進行空間探索實驗，撤去水中平臺，觀察并記錄小鼠60 s內穿越原平臺所在位置的次數及在此象限的停留時間。

1.7 樣品的采集與預處理

小鼠乙醚麻醉，去眼球取血置于1.5 mL離心管（EP內涂肝素），離心10 min（4℃，12 000 r/min），取上清液，置于-80℃冰箱保存。預處理：取100 μL樣品加入200 μL乙腈，渦旋，離心，取上清后，于氮氣下吹干，用100 μL初始流動相復溶，再次渦旋，離心，取上清，重復2次，后取5 μL進入液相色譜系統。

1.8 色譜和質譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLCRBEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm Waters，Made in Ire1and），流動相A1為0.1%甲酸水，B1為0.1%甲酸乙腈，流速0.25 mL/min。梯度洗脫：0 min，80%A1；0～1 min，50%～80%A1；1.0～4.5 min，35%～50%A1；4.5～12.0 min，0%～35%A1；12～13 min，0～80%A1；13～14 min，80%A1。進樣量5.0 μL，柱溫30℃。

質譜條件：采用正離子全掃描方式，掃描范圍m/z 100～1000。ESI為離子源，毛細管電壓3.2 V，錐孔電壓30 V；脫溶劑氣為氮氣，流速600 L/h，溫度350℃。同時進行MS/MS二級掃描獲得多級質譜碎片信息。

1.9 統計學方法

水迷宮數據經SPSS 19.0分析，計量資料用均數±標準差（）表示，三組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用Tukey檢驗，方差不齊時采用K-W檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。代謝組學數據：運用MassLynx V4.1對數據分析，經主成分分析（PCA）得到得分圖及載荷圖，再根據載荷圖上對各組分組起重要作用的點進行二級掃描，根據二級圖譜，查找相關的數據庫（HMDB http：//www.hmdb.ca/和LIPID MAPS http：//www.1ipidmaps.org/等），從而得出AD的潛在生物標志物。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

隨著訓練天數的增加，與對照組小鼠比較，AD模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長，且其在目標象限內停留時間明顯縮短，穿越平臺次數明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。與AD模型組小鼠比較，治療組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，在目標象限內停留時間顯著延長，穿越平臺次數明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 小鼠血漿UPLC-MS分析

2.2.1 血漿代謝組學分析PCA得分圖分析，對照組和AD模型組完全分開，界限明顯，治療組處于對照組和AD模型組之間，證明黑水纈草提取物干預后AD小鼠血漿代謝物發生明顯變化。見圖1。

表1 黑水纈草提取物對AD模型小鼠逃避潛伏期、目標象限停留時間及穿越平臺次數的影響（）

表1 黑水纈草提取物對AD模型小鼠逃避潛伏期、目標象限停留時間及穿越平臺次數的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與AD模型相，**P＜0.05；AD：阿爾茨海默病

組別只數目標象限停留時間（s）逃避潛伏期（s）第1天第2天第3天第4天第5天穿越平臺次數（次）對照組AD模型組治療組8 8 8 58.90±0.05 59.92±0.07 59.90±0.05 42.76±10.50 57.45±5.26 54.40±9.55**34.08±10.34 50.53±5.34*43.10±10.40**29.65±9.49 43.02±9.65*35.19±3.35**22.42±6.25 40.25±6.64*32.81±4.33**19.07±6.08 11.84±4.69*15.68±4.54**5.00±1.05 2.00±0.82*3.90±1.52**

圖1 三組主成分分析后得到的得分圖

2.2.2 潛在生物標志物鑒定經PCA分析，確定了10種生物標志物。標志物的峰強度及黑水纈草作用后峰強度的變化見圖2。

圖2 三組潛在生物標志物的峰強度

3 討論

AD病因及發病機制復雜，目前尚缺乏有效的治療藥物。中藥及其提取物質具有多靶點、多途徑、多方式等作用特點，已成為人們研究的熱點。

本研究通過水迷宮實驗發現，與對照組比較，AD小鼠學習記憶及空間探索能力明顯下降，黑水纈草提取物干預后，小鼠學習記憶及空間探索能力明顯提高，差異均有統計學意義（P＜0.05），說明黑水纈草提取物可改善AD小鼠的學習記憶及認知功能。以上實驗表明Aβ小鼠造模成功，具備AD的典型行為學改變，同時說明了黑水纈草對AD具有治療作用。

本研究運用UPLC-MS技術研究AD小鼠血漿代謝物的變化。確定了10種AD血漿生物標志物，經黑水纈草作用后，AD小鼠血漿中的10種標志物的含量均明顯增加，表明黑水纈草對AD有治療作用，其作用與氨基酸、磷脂和鞘脂代謝等某些代謝特定通路的調控作用有關。

組氨酸是一種重要的氨基酸，同時它是許多生物活性物質的前體物質，如組胺。有大量研究顯示，組胺能神經元系統與精神和神經退行性疾病（AD、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥）有關［5-7］。近年來有研究發現，AD患者血中組胺濃度升高，其有可能是疾病初期機體的代償機制所致，或是因攜帶載脂蛋白E4等位基因的AD患者血腦屏障被破壞所致［8］。本研究發現AD小鼠血漿組氨酸含量明顯下降，黑水纈草提取物干預后，組氨酸含量呈上升趨勢，從代謝水平上證明了黑水纈草對AD有治療作用。以上研究表明組胺能神經系統受損與AD關系密切，可能是AD的發病機制之一，組氨酸是AD的潛在生物標志物。

磷脂代謝異常是AD的特征性病理學變化之一［9］。溶血卵磷脂（LPC）是細胞膜磷脂的降解產物，在維持膜的穩定性中起重要作用，同時它也是重要的生物活性物質，參與細胞多種信號轉導過程。有研究表明LPC能引起神經元鞘脫髓鞘、軸突變性和神經元凋亡等［10］。LPC是磷脂酶A2（PLA2）的催化產物，其生成后迅速被乙酰輔酶A乙酰化形成維持神經元細胞膜的重要成分。有研究發現AD患者腦內頂部及顳葉部乙酰輔酶A活性增強［11］，同時又有研究發現多種血漿LPC對PLA2活性具有抑制作用［12］。多位學者發現AD患者血漿中LPC含量下降［13-16］。本實驗結果表明黑水纈草通過調控LPC的代謝，改善AD的癥狀。

鞘氨醇是復雜神經鞘脂類合成的前體物質［17］，而鞘脂類是一類重要的信號分子，參與多種生理功能調節，例如神經元生長、細胞識別、信號轉導等［18］。有研究發現AD患者腦組織和血漿中神經酰胺含量升高［19-20］。另有學者發現AD小鼠血漿中鞘脂類含量下降［13］。在本研究中，AD小鼠血漿中十六碳鞘磷脂、二氫神經鞘氨醇、4-羥雙氫（神經）鞘氨醇（C18、C20）含量顯著下降，其均屬于神經鞘脂類，在細胞功能的維持中起著一系列至關重要作用。而黑水纈草提取物治療后四者含量均明顯上升，證明黑水纈草提取物通過干預AD小鼠的脂質代謝，從而起到抗AD作用。

本研究運用UPLC-MS/MS技術對黑水纈草提取物干預的Aβ23～35小鼠模型血漿代謝物譜進行分析，確定了10種AD的生物標志物，并發現黑水纈草提取物是通過干預氨基酸、磷脂、鞘脂等相關代謝通路治療AD。

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Metabonomics study on the effect of Valeriana amurensis extractive for model mice with Alzheimer disease

WANG Zhe1LI Wei2LI Jingyuan1LI Lin1LI Naijing1
1.Department of Cadre Ward，Shengjing Hospita1 of China Medica1 University，Liaoning Province，Shenyang110016，China；2.Teaching and Research Office of Pharmaceutica1 Ana1ysis，Shenyang Pharmaceutica1 University，Liaoning Province，Shenyang110016，China

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Valeriana amurensis extractive for A1zheimer disease（AD）by u1tra-performance 1iquid chromatography-mass spectrometry（UPLC-MS）.Methods KM ma1e mice were divided into three groups：contro1 group（2%Tween-80 so1vent），AD mode1 group（2%Tween-80 so1vent），treatment group（95%EtOH extract of Valeriana amurensis 2 g/kg），a11 mice were given drugs by gavage for 30 days.Morris water maze and UPLC-MS/MS technique were conducted in the experiment.Results In the p1ace navigation test，mice in the AD group took much more time to reach the p1atform on the 1ast three training days compared to the contro1 group（P＜0.05）.The treatment group reduced escape 1atency compared to the AD group on 1ast 4 days（P＜0.05）.In the spatia1 exp1oration test，the tota1 time spent in the target quadrant and the number of mice that exact1y crossed the previous position of the p1atform in AD mode1 group were c1ear1y shorter and 1ower than those of the contro1 group（P＜0.05）.However，mice in the treatment group showed 1onger time spent in the target quadrant and higher frequencies of p1atform crossings compared to the AD group（P＜0.05）.By means of UPLC-MS，a tota1 of ten kinds of ana1ytes were identified，which were L-Histidine，C18 PHS，Hexadecasphinganine，LPC C22∶6，LPC C18∶2，LPC C16∶0，LPC C20∶4，LPC C18∶1，dihydrosphingosine and C20 PHS.When compared to contro1 group，the 1eve1s of ten kinds of markers in AD mode1 group were significant1y reduced（P＜0.05 or P＜0.01）.But the contents of ten kinds of markers in mice p1asma in the treatment group were obvious1y increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Valeriana amurensis extract can improve the cognitive function of AD mice，its mechanism is c1ose1y re1ated to amino acids，phospho-1ipids and sheath 1ipid metabo1ism as we11 as re1ated metabo1ic pathways.

A1zheimer disease；Valeriana amurensis；Metabo1omics；Biomarkers

R749.16

A

1673-7210（2016）07（c）-0004-04

2016-02-29本文編輯：張瑜杰）

國家自然科學基金資助項目（81203002）。

王喆（1989-），女，中國醫科大學附屬盛京醫院2014級老年醫學專業在讀碩士研究生；研究方向：老年醫學。

李乃靜（1972-），女，博士，教授；研究方向：老年醫學。