酶法制備青錢柳茶湯的工藝研究

黃瑤，高年芬，譚俊呈，易弋，陳潔，黃建星，陳振坤

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.柳州市青錢柳農業科技開發有限公司，廣西柳州545006）

酶法制備青錢柳茶湯的工藝研究

黃瑤1，高年芬1，譚俊呈2，易弋1，陳潔1，黃建星2，陳振坤2

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.柳州市青錢柳農業科技開發有限公司，廣西柳州545006）

為了探索制備青錢柳茶湯的新工藝新方法，利用雙酶（纖維素酶∶果膠酶=2∶1，m／m）水解法對青錢柳的茶湯制備條件進行研究.結果表明，青錢柳茶湯制備工藝最優條件為：雙酶添加量為1.5％（m／v），反應溫度70℃，反應時間140min，反應pH值5.0.此條件下青錢柳茶湯中茶多酚的提取率為4.33％，游離氨基酸總量的提取率為4.64％.雙酶水解法制備茶湯可以獲得較理想的提取效果，為青錢柳茶的市場開發提供科學的參考依據.

青錢柳茶；纖維素酶和果膠酶；茶多酚；游離氨基酸

0　引言

青錢柳（Cyclocaryapaliurus（Bata1.）Iljinskaja）又名青錢李、搖錢樹等，是一種高大速生喬木，奇數羽狀復葉，系胡桃科青錢柳屬植物，是中國特有的單種屬植物，也是國家重點保護的瀕危植物之一.青錢柳產于長江以南，多生于海拔420m～2 500m的山區、溪谷、林緣、林內或石灰巖山地，主要分布于安徽、江西、江蘇、浙江、臺灣、湖北、湖南、四川、貴州、廣西、廣東和云南等地.現有的青錢柳資源主要是天然林，為了加大青錢柳的應用和產業化進程，20世紀80年代以來一直有研究人員對其人工栽培的有性繁殖和無性繁殖方法進行探索，并取得了提高出苗率和提高扦插成活率等成果.青錢柳樹葉泡出的茶湯甘甜滋潤，生津止渴，被認為具有清熱解暑、防病治病等功效，故又被老百姓稱為“甜茶”、“神茶”［1］.研究表明，青錢柳葉含有豐富的化學成分如黃酮類、多糖、酚酸類以及多種礦物質和氨基酸等，具有降血糖、降血壓、降血脂和增強免疫力等功效［2-6］.

目前，青錢柳開發的保健產品主要以制茶為主.有研究表明纖維素酶和果膠酶能促進茶葉的提取率，提高茶葉的利用率［7］.利用酶法制備的茶湯不但可以很大程度的留存了茶葉中的活性成分，而且還能夠獲得更好的風味，更有益身體健康.采用復合酶解法可以有效提高茶湯中的茶多酚、咖啡堿和茶多糖的含量［8］.本研究利用纖維素酶和果膠酶復合使用的雙酶法制備青錢柳茶湯，因為茶多酚和氨基酸在茶湯中是主要的營養物質和生物活性成分，所以本研究以茶多酚和游離氨基酸含量為指標，研究青錢柳茶湯的最佳制備工藝，為青錢柳茶的市場開發提供科學的參考依據.

1　材料和方法

1．1材料

青錢柳葉：由柳州市青錢柳農業科技開發有限公司提供，采于廣西柳州三江縣，鮮葉曬干成生茶葉.纖維素酶、果膠酶：BR，產于上海如吉生物科技發展有限公司，添加時按質量比（m／m）纖維素酶∶果膠酶=2∶1復合使用［9］.

1．2方法

1.2.1單因素條件篩選

準確稱量青錢柳生茶葉1．0 g放入50mL錐形瓶中，添加復合酶，在不同梯度的茶水比、酶用量、反應溫度、反應時間、反應pH值的試驗條件下進行酶解反應后，90℃使酶失活15min，過濾，3 500 r／min離心10min，取上清液檢測不同條件下提取液中茶多酚和游離氨基酸提取率，進行單因素條件篩選．

1．2．2測定方法

1．2．2．1茶多酚的測定：酒石酸亞鐵比色法［10］；

分別吸取1mL樣液放入25mL的比色管中，依次添加蒸餾水4mL和酒石酸亞鐵溶液5mL，充分混勻，用pH 7．5磷酸緩沖液定容到25mL，用10mm比色杯，在波長540 nm處，以蒸餾水為空白溶液作參比，測定吸光度（A1）．同時吸取相等的樣液放入25mL的比色管中，添加蒸餾水4mL，用pH 7．5磷酸緩沖液定容至25mL，用10mm比色杯，在波長540 nm處，以蒸餾水為空白溶液作參比，測定吸光度（A2）．

1．2．2．2游離氨基酸總量的測定：茚三酮比色法［11］．

標準曲線的繪制：分別移取濃度不同的氨基酸溶液1．0mL放入25mL的具塞比色管中，分別依次添加pH值8．0的磷酸鹽緩沖液0．5mL和2％濃度的茚三酮溶液0．5mL，于沸水浴中加熱15min．冷卻至室溫后添加水定容至25mL，靜置10min后，用10mm比色皿，在波長560 nm處測定吸光度，繪制標準曲線．

正是因為這個原因，外圓內方的全新一代路虎發現在剛剛推出的時候于設計方面迎來了很大的爭議。其實觀點的爭議并不可怕，無數經典的例子告訴我們，認知的不同的確能夠成就情節跌宕的故事并塑造出一個個獨立且鮮活的個體。這輛路虎發現顯然能夠用設計中的“圓”擁抱和以往不同的支持者，并用性格里的“方”再次啟發人們心中對經典的認知。

樣品的測定：準確移取樣液1mL放入25mL的具塞比色管中，添加pH值8．0的磷酸鹽緩沖液0．5mL和濃度為2％的茚三酮溶液0．5mL，于沸水浴中加熱15min．待冷卻至室溫后加蒸餾水定容到25mL．靜置10min后，用10mm比色皿，在波長為560 nm處，以試劑空白溶液作參考比值，測定其吸光度，根據氨基酸標準曲線的公式求出溶液中氨基酸的含量．

1．2．3提取率的計算［9］

式（1）中：L——稀釋倍數；C——標準曲線上得到的游離氨基酸含量；M——樣品質量，g．

式（2）中：A1——樣品顯色后吸光度；A2——樣品底色吸光度；L——稀釋倍數；M——樣品質量，g；1．957——在540 nm波長下，10mm比色杯，吸光度為0．5時，1mL茶樣液中茶多酚的含有量等于1．957mg．

2　結果和分析

2．1游離氨基酸標準曲線的制備

以吸光度（OD值）為縱坐標，茶氨酸含量為橫坐標繪制游離氨基酸總量標準曲線見圖1．得回歸直線方程為y＝0．636 57x－0．245 53（y——吸光度，x——質量濃度，mg／mL），R2＝0．998 52．

2．2茶水比對提取效果的影響

青錢柳茶水比（m／v）分別設置為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35等6個不同梯度，其他酶解條件設定為復合酶添加量0．9％（m／v），水解溫度70℃，水解時間50min，pH值5．0進行試驗，測定茶湯中的茶多酚、游離氨基酸總量的提取率，結果見圖2和圖3．

由圖2、圖3可知：隨著茶水比例的變化，茶多酚的提取率和游離氨基酸總量的提取率呈下降趨勢，當茶水比為1∶10時提取率最高，茶多酚和游離氨基酸總量的提取率分別為3．34％和4．44％，說明溶劑的增加對于茶多酚和游離氨基酸的浸出沒有起到作用，并由于稀釋作用而使溶質的含量下降；因此，選擇1∶10為最佳茶水比．

圖1　游離氨基酸總量標準曲線Fig．1 Standard curve of total free amino acid

圖2　茶水比對茶多酚提取率的影響Fig.2 Effect of tea-leaves and liquid proportion on extraction ratio of tea polyphenols

圖3　茶水比對游離氨基酸提取率的影響Fig.3 Effect of tea-leaves and liquid proportion on extraction ratio of free amino acid

2.3pH值對提取效果的影響

酶作用的pH值分別設置為4．0，4．5，5．0，5．5，6．0等5個不同梯度，其他酶解條件設定為茶水比為1∶10，復合酶添加量0．9％，酶解溫度70℃，酶解時間50min進行試驗，測定茶湯中的茶多酚、游離氨基酸總量的提取率，結果見圖4和圖5．

pH不僅對酶的活性有影響，還對底物的解離形態有一定影響．在最適pH條件下進行提取，茶多酚、游離氨基酸總量的提取效率最高［12］．由圖4和圖5可知：隨著pH值的增大，茶多酚和游離氨基酸總量的提取率呈現先上升后下降趨勢，當pH值為5．0時，茶多酚和游離氨基酸總量的提取率達到最高峰值，分別為3．78％和4．48％，此時復合酶酶活性最高，不僅對細胞壁造成破壞，還影響了傳質阻力，從而有益于各組分的提取；因此，選擇pH值5．0為最佳pH值．

圖4　pH值對茶多酚提取率的影響Fig.4 Effect of pH on extraction ratio of tea polyphenols

圖5　pH值對游離氨基酸總量提取率的影響Fig.5 Effect of pH on extraction ratio of free amino acid

2.4酶解溫度對提取效果的影響

酶解溫度分別設置為50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃等6個不同梯度，其他酶解條件設定為茶水比為1∶10，復合酶添加量0．9％，酶解溫度70℃，酶解時間50min，pH值5．0進行試驗，測定茶湯中的茶多酚、游離氨基酸總量的提取率，結果見圖6和圖7．

由圖6～圖7可見：隨著酶解溫度的升高，茶多酚和游離氨基酸總量提取率呈先上升后下降的趨勢，在70℃時復合酶活性最高，最大程度裂解細胞壁，此溫度下的茶多酚和游離氨基酸總量的提取率達到最高，分別為3．73％和4．85％；酶解溫度高于80℃后，酶活力減弱，提取率呈現下降趨勢；因此，選取酶解溫度70℃為最適作用溫度．

圖6　酶解溫度對茶多酚提取率的影響Fig．6 Effect of enzymolysis temperature on extraction ratio of tea polyphenols

圖7　酶解溫度對游離氨基酸總量提取率的影響Fig．7 Effect of enzymolysis temperature on extraction ratio of free amino acid

2．5酶解時間對提取效果的影響

酶解時間分別設置為50min，80min，110min，140min，170min，200min等6個不同梯度，其他酶解條件設定為茶水比為1∶10，復合酶添加量0．9％，酶解溫度70℃，pH值5．0進行試驗，測定茶湯中的茶多酚、游離氨基酸總量的提取率，結果見圖8和圖9．

由圖8～圖9可見：茶多酚和游離氨基酸總量提取率隨著酶解時間的延長呈現先上升后下降趨勢，酶解時間為140min和170min時茶多酚提取率較為接近最大值，分別為3．85％和3．87％；游離氨基酸總量提取率在140min時達到最大值，為4．63％，隨后呈下降趨勢；可見酶解時間過長會影響酶活力，從而影響了茶湯營養成分的提取效果；因此，選擇140min為最佳酶解時間．

圖8　酶解時間對茶多酚提取率的影響Fig．8 Effect of enzymolysis time on extraction ratio of tea polyphenols

圖9　酶解時間對游離氨基酸總量提取率的影響Fig．9 Effect of enzymolysis time on extraction ratio of free amino acid

2．6酶添加量對提取效果的影響

復合酶添加量（m／v）分別設置為0．3％，0．6％，0．9％，1．2％，1．5％，1．8％等6個不同梯度，其他酶解條件設定為茶水比為1∶10，酶解溫度70℃，酶解時間140min，pH值5．0進行試驗，測定茶湯中的茶多酚、游離氨基酸總量的提取率，結果見圖10和圖11．

由圖10～圖11可知：隨著復合酶用量的增加，茶多酚和游離氨基酸的提取率均呈現先升高后下降趨勢．酶用量為0．9％至1．5％時，茶多酚提取率均達到為4．30％以上，酶用量為1．5％時提取率為4．33％；游離氨基酸總量的提取率在復合酶用量為1．2％時達到4．14％，酶用量為1．5％時達到最高值，為4．64％．繼續增大酶用量，提取率呈現下降趨勢．分析原因可能是：隨著酶用量增加，酶與底物作用的機會逐漸增多，酶的催化效率也逐漸升高，當底物與酶完全結合后，繼續增加酶量就會抑制酶的活性；因此，選擇1．5％為最佳復合酶添加量．

圖10　酶添加量對茶多酚提取率的影響Fig．10 Effect of enzyme concentration on extraction ratio of tea polyphenols

圖11　酶添加量對游離氨基酸總量提取率的影響Fig．11 Effect of enzyme concentration on extraction ratio of free amino acid

3　小結

酶的應用領域廣泛［13－14］，將酶解法應用于浸提茶葉制備茶湯，具有反應特異性強、條件簡便、時間短、效率高、環保節能等特點，已引起了科研人員的普遍關注，隨著時間的推移，酶法提取勢必會成為茶葉產品開發研究的首要技術措施［15］．酶法提取茶多酚不僅可以提高提取率，而且可以使茶多酚的主要生物活性組分——兒茶素的氧化損失減少，可見該法具有廣闊的應用前景［16］．有研究提出茶葉的半纖維素和纖維素的表層上覆蓋有果膠類物質，利用果膠酶來降解果膠構成的保護膜，可以促進半纖維素和纖維素的分解［17］．

在茶飲料的生產標準中，茶多酚和氨基酸含量是重要的質量指標，茶多酚是茶葉中酚類物質及其衍生物的總稱，具有消除機體有害自由基、抗衰老、抗輻射、抑制癌細胞、抗菌殺菌等功效．氨基酸是構建生物機體的眾多生物活性大分子之一，是構建細胞、修復組織的基礎材料，在茶湯中是主要的營養成分，也是造成茶湯味道甘美的主要因素．本研究利用纖維素酶和果膠酶復合使用的雙酶解法對青錢柳茶葉進行茶湯浸提，以茶多酚和游離氨基酸總量的提取率為指標考察茶湯制備效果，并得到最佳浸提工藝條件為：茶水比為1∶10，雙酶（纖維素酶∶果膠酶＝2∶1，m／m）添加量為1．5％（m／v），酶解反應溫度70℃，酶解反應時間140min，酶解pH值5．0，在此條件下青錢柳茶湯中的茶多酚和游離氨基酸可獲得較理想的提取效果，制備得到的茶湯顏色清亮透明，具有青錢柳茶特有的甜香風味．可見使用雙酶法制備青錢柳茶湯可較好地保持其風味特點，又能提高其營養成分茶多酚和氨基酸的提取率，若將該法應用于青錢柳茶飲料制備的工業化生產，預計可有良好的應用前景．

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（學科編輯：黎婭）

The preparation of the Cyclocarya paliurus tea with enzyme method

HU ANG Yao1，GAO Nian-fen1，TAN Jun-cheng2，YI Yi1，CHEN Jie1，HUANG Jian-xing2，CHEN Zhen-kun2
（1．School of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2．Liuzhou Cyclocarya paliurus Agricultural Technology Development Limited Company，Liuzhou 545006,China）

Double enzyme method(cellulose:pectinase=2∶1,m/m)was used to prepare Cyclocarya paliurus tea, and the preparation process conditions were studied.The results showed that the optimal preparation process were as fellows:double enzyme concentration was1.5％(m/v),reaction temperature at70℃,reaction time for 140min, reaction pH of 5.0.The extraction ratio of tea polyphenols 4.33％and the extraction ratio of total free amino acid 4.64％from Cyclocarya paliurus tea soups were obtained in the optimal conditions.Double enzyme method can be used for tea preparation and good extraction effect can be obtained.The paper gives reference to market development of Cyclocarya paliurus tea.

Cyclocar ya paliurus tea;cellulase and pectinase;tea polyphenols;free amino acids

TS272.55

A

2095-7335（2016）04-0116-06

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.04.021

2016-04-27

廣西大學生創新創業訓練計劃項目（201410594042）資助.

黃瑤，碩士，講師，研究方向：生物技術，E-mail：5530836＠qq.com.