食品中黃曲霉毒素B1 ELISA試劑盒檢測方法的建立及驗證

謝體波 易重任 陳旭 等

摘要：建立了黃曲霉毒素B1酶聯免疫試劑盒檢測的方法，并通過對食用油、花生、谷物中黃曲霉毒素B1測定進行驗證。結果表明，在25 ℃條件下加入50 μL標準品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標二抗反應30 min變異性最小；ELISA試劑盒檢測靈敏度高，對食用油、谷物、花生樣品中黃曲霉毒素B1最低檢測限分別為88.82 ng/L和48.51、176.56 ng/kg；平均回收率和變異系數符合相關規定；與高效液相色譜法相比，檢測結果一致。

關鍵詞：黃曲霉毒素B1；ELISA試劑盒；食用油；花生；玉米

中圖分類號：R155.5；TS201.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-1008-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.048

Establishment and Validation of Aflatoxin B1 ELISA Kit Test Method in Foods

XIE Ti-bo1，YI Zhong-ren1，CHEN Xu1，LIU Tian-lei1，ZHANG Lei1，WEI Li-li1，

LUO Gui-kun1，TAO Guang-can1，HE Fang-yang1，2

（1. Gui Zhou Kwinbon Food Safety Science-Technology Co.， Ltd.， Guiyang 550009，China；

2.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.， Ltd.， Beijing 100012，China）

Abstract：This experiment has established the detection method of aflatoxin B1 whit ELISA kit，and based on the determination of aflatoxin B1 in cooking oil， peanuts，corn was validated，the results show that under the condition of 25 ℃，50 μL standard solution，50 μL antibody working liquid， 50 μL enzyme mark two antibody reacted 30min，variability was minimum；ELISA kit is high detection sensitivity，the aflatoxin B1 minimum detection limit in samples of cooking oil，corn，peanuts，were 88.82 ng/L，48.51 ng/kg，176.56 ng/kg；The average recovery and variation coefficient in accordance with relevant provisions and HPLC.

Key words： aflatoxin B1； ELISA kit； edible oil； peanut； maize

黃曲霉毒素（AFT）是由寄生曲霉和黃曲霉在生長的后期分泌產生的一類次生代謝物，是自然界中已發現的理化性質最穩定的一類霉菌毒素[1]，具有極強毒性和致癌性。黃曲霉毒素在濕熱地區飼料和食品中出現的幾率較高，尤其是在谷物和糧油食品中出現的幾率極高，導致榨出的油及飼料中也含有黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1在曲霉毒素群中的毒性最強，分布最廣[2]。

目前對食品、農產品中黃曲霉毒素檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[3]、色譜串聯質譜（LC/MS/MS）[4]、薄層色譜法[5]、熒光光譜法（FS）[6]和酶聯免疫吸附法（ELISA）[7]等。ELISA是測定黃曲霉毒素含量的常用方法，所涉及的儀器及試劑比較少，操作比較簡單，被很多企事業單位所采用[8]。本試驗建立了ELISA對黃曲霉毒素B1的檢測方法，并通過對食用油、花生、谷物中黃曲霉毒素B1的檢測驗證了該方法的精密度、準確度、穩定性等，以期為黃曲霉毒素酶聯免疫試劑盒的制備提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與主要試劑 食用油、花生、谷物均為市售；黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒，北京勤邦生物技術有限公司；黃曲霉毒素B1標準品，純度≥99%，美國Sigma公司；抗體工作液，酶標二抗，底物A液和B液，終止液，PBST洗液；乙腈、乙酸乙酯、正己烷、氫氧化鈉、濃鹽酸、十二水合磷酸氫二鈉均為分析純，北京化學試劑公司；去離子水（自制）。

1.1.2 主要儀器 8010S勻漿機，MK3酶標儀，DSY-Ⅲ氮吹儀，2000-SBL電子天平，KS-I1振蕩器，Anke GL-20G-lI高速離心機，QL-901漩渦混合器，微量移液器（單道20～200 μL、100～1 000 μL，多道250 μL ）：Anglent 1200高效液相色譜儀。

1.2 檢測方法的建立

1.2.1 加樣方式的確定

1）分別向板孔中加入標準品溶液、樣品溶液，用常規抗體稀釋液稀釋1∶2×104的抗體和用常規酶標二抗稀釋液稀釋1∶2 000的酶標二抗，振蕩混勻，25 ℃避光反應30 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反應20 min，加入50 μL終止液終止反應。

3）分別測定零標準品OD值、谷物樣本OD值、0.36 μg/kg谷物OD值、0.18 μg/L標準品OD值，以零標準OD值為1.5～2.0、谷物樣本OD值與零標準品OD值偏差小、0.36 μg/kg陽性谷物樣品的OD值與0.18 μg/L標準品OD值偏差小、0.18 μg/L標準品OD值相對較小為判定標準，確定較好的加樣方式。

1.2.2 反應溫度的確定

1）向板孔中加入標準品、樣品溶液50 μL，用常規抗體稀釋液稀釋1∶2×104的抗體50 μL和用常規酶標二抗稀釋液稀釋1∶2 000的酶標二抗50 μL，振蕩混勻，4、25 ℃下避光反應30 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反應20 min，加入50 μL終止液終止反應。

3）分別測定零標準品OD值、0.02 μg/L標準品OD值、谷物樣本OD值，計算抑制率，以零標準品OD值為1.5～2.0，谷物樣本OD值接近零標準品OD值，抑制率在70%～80%為判定標準，選擇較好的反應溫度。

1.2.3 抗原、抗體、酶標二抗反應時間的確定

1）向板孔中加入標準品溶液50 μL、用常規抗體稀釋液稀釋1∶2×104的抗體50 μL和用常規酶標二抗稀釋液稀釋1∶2 000的酶標二抗50 μL，振蕩混勻，25 ℃下避光反應15、30、60 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反應20 min，加入50 μL終止液終止反應；

3）測定零標準品OD值，重復3次，每次做6個對照孔，計算不同反應時間測定值的變異度CV（%）。

1.2.4 標準曲線的繪制

1）根據上述選定的加樣方式、反應溫度、反應時間為分析條件，用0、0.02、0.06、0.18、0.54、1.62 μg/L濃度的標準溶液進行ELISA檢測，測定OD值。

2）以黃曲霉毒素B1濃度為橫坐標，各對應濃度的抑制率（%）為縱坐標，制作標準曲線，計算回歸方程及相關系數，根據線性方程計算IC50。

以優化的ELISA條件，對所有濃度的標準溶液進行測定，每個濃度設置3次重復，根據測定結果制作標準曲線，測定零標準品OD值、IC50、變異系數、R2、0.02 μg/L標準品抑制率及對空白谷物樣本添加0.36 μg/kg的回收率。

1.3 樣本前處理

1.3.1 食用油樣本 吸取200 μL樣本至2 mL聚苯乙烯離心管中；加入1 mL復溶工作溶液，加入0.5 mL正己烷，振蕩5 min，室溫離心5 min；除去上層正己烷相，取下層50 μL用于分析。

1.3.2 谷物、花生樣本 用均質器均質樣本；稱取（2.0±0.05） g樣本至50 mL聚苯乙烯離心管中；加入3.0 mL乙腈，再加入3.0 mL去離子水，振蕩5 min，室溫離心5 min；移取3.0 mL上層清液至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入4.5 mL三氯甲烷，振蕩5 min，室溫離心5 min；去除上層液體，取3 mL下層有機相至10 mL干凈玻璃試管中，于50～60 ℃水浴氮氣流下吹干；加入1 mL正己烷，渦動30 s溶解干燥殘留物，加入1 mL復溶工作液，用渦旋儀渦動30 s，室溫離心5 min；除去上層正己烷相，取下層水相50 μL用于分析。

1.4 ELISA檢測試劑盒技術參數的確定

1.4.1 試劑盒靈敏度的確定 分別測定3個批次試劑盒標準曲線的IC50抑制濃度，確定該值浮動范圍。檢測限（LOD）計算公式如下：

LOD=X+3×■

式中，X為重復測定空白樣品的平均值，n為樣品數量。

1.4.2 試劑盒特異性的測定 選擇與黃曲霉毒素B1類似結構的3種物質，將不同濃度的黃曲霉毒素B1類似物，替代黃曲霉毒素B1標準溶液，測定其標準曲線，并計算IC50抑制濃度，計算交叉反應率。

交叉反應率=

■×100%

1.4.3 試劑盒精密度和準確度的測定 取食用油樣品分別添加100、200和400 ng/L黃曲霉毒素B1，取花生樣品分別添加200、400和800 ng/kg黃曲霉毒素B1，取谷物樣品分別添加50、100和200 ng/kg黃曲霉毒素B1，每種樣品、每個濃度各6次重復，用試劑盒提供的操作方法提取測定。抽取3批試劑盒，每批試劑盒測定同一份樣品2次，分別計算測定樣品的回收率及批內、批間變異系數。

隨機抽取花生、谷物樣本各20份，分別用本試劑盒方法和儀器方法進行檢測。儀器方法參考文獻[9]中的第三法高效液相色譜法（對花生、谷物中黃曲霉毒素B1的檢出限為0.5 μg/kg）。

將制備好的試劑盒保存于2～8 ℃環境下，分別在8個時間段（第0、1、2、3、6、9、12、15月）取出做保存試驗，測定其IC50，添加100、200、400 ng/L食用油的回收率，添加200、400、800 ng/kg花生的回收率，添加50、100、200 ng/kg谷物的回收率；并將試劑盒保存于37 ℃和-20 ℃環境中，在4個時間段（第0、3、6、9天）取出做加速和凍融試驗。

2 結果與分析

2.1 加樣方式的確定

由表1可知，當加入50 μL標準品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標二抗進行反應時，零標準品OD值在1.5～2.0之間，谷物樣本OD值與零標準品OD值偏差較小，0.36 μg/kg陽性谷物樣品的OD值與0.18 μg/L標準品OD值偏差較小，故該方式為較好的加樣方式。

2.2 反應溫度的確定

由表2可知，加入50 μL標準品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標二抗于25 ℃下避光反應，測定的零標準品OD值在1.5～2.0之間，0.02 μg/L標準品的抑制率在70%～80%之間，谷物樣品的OD值與零標準品OD值偏差較小，故選擇反應溫度為25 ℃。

2.3 反應時間的確定

由表3可知，加入標準品50 μL、抗體50 μL、酶標二抗50 μL，25 ℃反應30 min，零標準品OD值均在1.5～2.0，且變異相對較小，故反應時間確定為30 min。

2.4 標準曲線的繪制

以優化的ELISA條件，對所有濃度的標準溶液進行測定，每個濃度設置3次重復，試驗結果見表4和圖1。

2.5 試劑盒靈敏度的確定

由表5結果可知，黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒標準曲線IC50的波動范圍為47.5～63.1 ng/L。

對陰性食用油、花生、谷物樣品進行20次檢測，測定結果的平均值加上3倍標準差即為試劑盒檢測實際樣品的最低檢測限，結果見表6。由表6可以看出，本試劑盒對食用油的最低檢測限為88.82 ng/L，對花生的最低檢測限為176.56 ng/kg，對谷物的最低檢測限為48.51 ng/kg。

2.6 試劑盒特異性的測定

試驗測得與黃曲霉毒素B1結構相似的3種物質黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的交叉反應率分別為81.3%、62%、22.3%。

2.7 試劑盒精密度和準確度的測定

對食用油樣品分別添加100、200和400 ng/L 3個濃度的黃曲霉毒素B1，樣品回收率為66.5%～93.2%；對花生樣品分別添加200、400和800 ng/kg 3個濃度的黃曲霉毒素B1，樣品回收率為66.6%～93.0%；對谷物樣品分別添加50、100和200 ng/kg 3個濃度的黃曲霉毒素B1，樣品回收率為65.8%～93.8%。批內和批間變異系數均小于15%。

2.8 與儀器方法的比較

以0.5 μg/kg為陽性判定線，低于陽性判定線的值，檢測結果以“—”表示，高于或等于陽性判定線的值以實際檢測結果表示（表7）。由表7可以看出，試劑盒檢測結果與儀器檢測結果相吻合。

2.9 試劑盒的穩定性

從表8中可看出，將試劑盒保存在2～8 ℃條件下，各樣品的陽性回收率都較高，可以一直保存12個月；在37 ℃和-20 ℃條件下保存時間都較短。

3 結論

本研究制備了黃曲霉毒素B1 ELISA快速檢測試劑盒，得出了制備該試劑盒的最佳條件，以食用油、谷物、花生為樣本，驗證了該檢測試劑盒的檢測效果，并將其檢測結果與HPLC檢測結果做了對照。結果表明，在25 ℃條件下加入50 μL標準品溶液、50 μL抗體工作液、50 μL酶標二抗反應30 min變異性最小；ELISA試劑盒檢測靈敏度高，對食用油、谷物、花生樣品中黃曲霉毒素B1最低檢測限分別為88.82 ng/L和48.51、176.56 ng/kg；平均回收率和變異系數符合相關規定；與高效液相色譜法相比，檢測結果一致。ELISA試劑盒耗時短，樣品前處理方法簡單、檢測設備投資少、成本低，能夠滿足批量產品中黃曲霉毒素的快速檢測。

參考文獻：

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