不同地區地木耳多糖紅外光譜與抗氧化活性研究

刁毅 劉濤 韓洪波

摘要：為了研究不同地區地木耳（Nostoc commune Vauch.）多糖的結構與體外抗氧化活性，用苯酚-硫酸法測定地木耳多糖含量，用傅里葉變換紅外光譜法分析多糖結構，用清除DPPH自由基法、清除超氧陰離子法、清除羥基自由基法測定不同地區地木耳多糖體外抗氧化活性。結果表明，不同地區地木耳多糖含量有差異，蓬溪和名山地木耳多糖含量高于南部地木耳多糖，含量分別為（18.29%±0.21%）和（17.18%±0.17%）。不同地木耳多糖紅外光譜峰形、位置相似，但峰強有差異。地木耳多糖對DPPH自由基、超氧陰離子、羥基自由基具有較強的清除能力；地木耳多糖抗氧化活性比地木耳提取液強，但比維生素C弱；隨著濃度增加，地木耳多糖抗氧化活力增強；蓬溪和名山地木耳多糖抗氧化活性強于南部地木耳多糖抗氧化活性。由此說明，不同地區地木耳多糖含量與其組成有差異，不同地區地木耳多糖抗氧化活性差異大。

關鍵詞：地木耳（Nostoc commune Vauch.）；多糖；傅里葉變換紅外光譜；抗氧化活性

中圖分類號：S646.6；O657.33；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0984-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.042

Study on FTIR and Antioxidative Activity of Polysaccharides in Nostoc commune

of Different Districts

DIAO Yi， LIU Tao， HAN Hong-bo

（College of Biological and Chemical Engineering Panzhihua University/Sichuan Province Key Laboratory of Characteristic

Biological Resources of Dry and Hot River Valley， Panzhihua 617000， Sichuan， China）

Abstract： In the article， the constitute and antioxidative activities of polysaccharides from Nostoc Commune were studied， and the antioxidative activities of polysaccharides were compared with antioxidative effects of extracts and Vc in order to provide the theoretical basis for application of N. commune. Concents of polysaccharides were determined by phenol-sulfuric acid reaction system. The chemical compositions and configuration of polysaccharides were studied by FTIR spectroscopy. And the antioxidative effects of polysaccharides were investigated by scavenging DPPH free radical， scavenging superoxide radical and scavenging hydroxyl free radical. As a result， contents of polysaccharides in N. commune from Pengxi and Mingshan were higher than from Nanbu. The structures and positions of main characteristic peaks were similar in polysaccharides of three samples， but the strengths of the peaks were different. Polysaccharides could scavenge DPPH free radical， superoxide radical and hydroxyl free radical， antioxidative abilities of polysaccharides were stronger than extracts， but their antioxidative properties were lower than that of Vc. And their antioxidative abilities increased with the increase of concentrations of polysaccharides. And the antioxidative effects of polysaccharides were stronger in N. commune from Pengxi and Mingshan than from Nanbu.

Key words： Nostoc commune Vauch.； polysaccharide； fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）； antioxidative activity

地木耳（Nostoc commune Vauch.）屬于藍藻門（Cyanophyta）念珠藻屬（Nostoc）藻類。地木耳在中國分布廣泛，營養豐富，具有一定的醫療和保健價值；其中蛋白質含量為14.60%～21.81%，脂類物質含量為0.20%～4.28%，總糖含量為0.53%～23.80%，還含有多種金屬元素和豐富的維生素[1，2]。

念珠藻多糖種類多樣，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗旱、抗炎癥等多種作用，能夠顯著地增強機體免疫能力，還能促進農作物的生長[3-5]。馬文杰等[6]報道地木耳提取液對超氧陰離子自由基和羥基自由基具有清除能力；孫強等[7]報道發狀念珠藻多糖具有清除超氧陰離子能力；苗元振等[8]發現真菌多糖具有抗氧化作用；張唐偉等[9]報道地木耳多糖對DPPH自由基和羥基自由基具有較強的清除作用，但對超氧陰離子自由基幾乎沒有清除效果；湯俊等[10]報道地木耳多糖提取物具有清除超氧陰離子自由基和羥基自由基作用。但不同地區地木耳多糖含量與組成差異、抗氧化作用差異尚未見報道。本試驗以不同地區野生地木耳為材料，分離多糖，分析多糖組成，分析不同地區地木耳多糖清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥基自由基的能力，討論不同地區地木耳多糖體外抗氧化活性差異，為地木耳的綜合應用研究提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用地木耳材料分別采自四川省南部縣、名山縣和蓬溪縣。采集地木耳材料后，洗凈泥沙，晾干，貯存備用。

1.2 試劑與儀器

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購于Sigma公司。乙醚、乙醇、抗壞血酸、鄰苯三酚、H2O2、FeSO4、氯仿、正丁醇等均為分析純。

722型分光光度計、索氏提取儀（上海精密科學儀器有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 地木耳提取液制備 將粉碎的蓬溪、名山和南部地木耳各取2 g，分別置于裝有600 mL蒸餾水的1 L錐形瓶中，靜置24 h后蒸發濃縮至300 mL，冷卻至室溫，過濾，將濾液定容至300 mL。

1.3.2 提取地木耳多糖 稱取5 g粉碎過篩的干燥地木耳粉末，用乙醚在65 ℃下索氏提取儀中回流1 h進行脫脂。脫脂后，與蒸餾水1∶90混勻，在90 ℃下水浴搖床上浸提6 h，冷凍離心，放入冰箱，重復4次。將水提液在80 ℃水浴鍋中濃縮，除去大部分水。將濃縮的水溶性多糖與正丁醇/氯仿混合液（V/V = 5∶2）按1∶1比例混合，振蕩20 min，冷凍離心，除去蛋白質，重復3次。水溶性多糖與95%乙醇按照1∶1比例混合，使多糖沉淀析出，用真空抽濾出水溶性多糖[9，11]。在-24 ℃下真空冷凍干燥、稱重。采用苯酚-硫酸法測定地木耳中多糖含量。平行測定3次，取其平均值。

1.3.3 地木耳多糖紅外光譜檢測 取干燥多糖樣品0.5 mg與50 mg溴化鉀混合在瑪瑙缽中研磨均勻并壓片，經傅里葉變換紅外光譜儀測定[12]，光譜掃描范圍4 000～400 cm-1，累計掃描16次，分辨率為4 cm-1。

1.3.4 清除DPPH自由基能力測定 配制不同濃度地木耳提取液和多糖溶液。用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，取不同濃度地木耳提取液或多糖溶液2 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL，混勻后室溫下暗反應30 min；以2 mL無水乙醇和2 mL蒸餾水混合作為空白對照調零，在517 nm下測定吸光度Ai。以2 mL樣品溶液和2 mL無水乙醇混合作為對照，在517 nm下測定吸光度Aj。以2 mL DPPH溶液和2 mL無水乙醇混合作為模型對照組，在517 nm下測定吸光度Ac[13-16]。以同樣的方法測定維生素C（VC）的吸光度。平行測定3次，取其平均值。DPPH自由基清除率計算公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

以清除率為縱坐標，地木耳濃度為橫坐標作圖，建立回歸方程，計算EC50值。

1.3.5 清除超氧陰離子能力測定 配制不同濃度地木耳提取液與多糖溶液。配制pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl溶液，用10 mmol/L HCl配制3 mmol/L鄰苯三酚溶液。取50 mmol/L Tris-HCl溶液4.5 mL，蒸餾水4.2 mL，25 ℃下保溫20 min，加入25 ℃下預熱的3 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL，混勻。以10 mmol/L HCl代替3 mmol/L鄰苯三酚溶液作為空白調零，在325 nm處每隔30 s測定一次吸光度A，線性范圍內每分鐘增加的吸光度為A1[13-16]。

取50 mmol/L Tris-HCl溶液4.5 mL，不同濃度地木耳提取液或多糖溶液4.2 mL混勻，其他步驟同上，在325 nm處每隔30 s測定一次吸光度A，線性范圍內每分鐘增加的吸光度為A2。以同樣的方法測定VC的吸光度。平行測定3次，取其平均值。EC50值計算方法同上。超氧陰離子清除率計算公式如下：

超氧陰離子清除率=[（A1-A2）/A1]×100%

1.3.6 清除羥基自由基能力測定 配制不同濃度地木耳提取液與多糖溶液。反應體系中含8.8 mmol/L H2O2、9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L用無水乙醇配制的水楊酸、不同濃度的地木耳提取液或多糖溶液各1 mL，以蒸餾水為參比，最后加入H2O2啟動反應，37 ℃下反應30 min，在510 nm處測定各濃度的吸光度Ax。以水為參比代替提取液或多糖，測定對照組吸光度A0。考慮到樣品自身的吸光度，以9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸-乙醇、不同濃度的地木耳提取液與多糖溶液溶液、蒸餾水各1 mL混合測定地木耳提取液與多糖的本底吸收度Ax0[13-16]。用同樣的方法測定VC的吸光度。平行測定3次，取平均值，EC50值計算方法同上。羥基自由基清除率計算公式如下：

羥基自由基清除率=[1-（Ax-Ax0）/A0）]×100%

2 結果與分析

2.1 不同地木耳中多糖含量測定

由表1可知，不同地區地木耳中多糖含量有差異，蓬溪和名山地木耳中多糖含量極顯著高于南部地木耳多糖含量。

2.2 地木耳多糖紅外光譜分析

從圖1可以看出3個不同地區地木耳多糖的特征峰值。在3 420 cm-1處有一強吸收峰，該吸收峰主要是由羥基伸縮振動所產生的；在2 920～2 990 cm-1附近出現的吸收峰是糖類C-H的伸縮振動吸收峰；在1 650 cm-1附近的吸收峰主要歸屬于酰胺基C=O的伸縮振動；在1 400 cm-1附近所出現的一個吸收峰主要是C-H的剪切式振動吸收所產生的；在1 250 cm-1處的吸收峰主要是C-N和N-H伸縮振動；在1 050 cm-1處的吸收峰主要是C-O伸縮振動；在840 cm-1處的吸收峰主要為α-吡喃環C-H變形振動[17，18]。3個不同地區地木耳多糖的紅外光譜圖峰形與峰位置相似，峰強度有差異，說明不同地區地木耳中多糖類型相似，但多糖含量有較大差異。

2.3 地木耳多糖抗氧化活性的測定

2.3.1 清除DPPH自由基能力的結果分析 由圖2可知，隨著地木耳多糖和提取液濃度增加，地木耳多糖和提取液對DPPH自由基清除率增加。蓬溪、名山和南部地木耳多糖對DPPH自由基清除作用強于地木耳提取液；蓬溪和名山地木耳多糖對DPPH自由基清除率高于南部地木耳多糖。地木耳提取液在8 g/L時對DPPH清除率達到最大，為（54.64% ± 3.12%）；蓬溪和名山地木耳多糖清除DPPH自由基清除率同樣在8 g/L時達到最大，分別為（91.57%± 2.10%）和（87.95%±2.70%）；而南部地木耳多糖在8 g/L時對DPPH自由基清除率為（72.84%±1.60%），比蓬溪和名山地木耳多糖對DPPH清除率低。VC在1 g/L時對DPPH自由基清除率達到（93.78%±1.40）%。蓬溪、名山、南部地木耳多糖對DPPH自由基清除率大于地木耳提取液，但地木耳多糖和地木耳提取液對DPPH自由基清除率均低于VC對DPPH自由基清除率。

2.3.2 清除超氧陰離子能力的結果分析 由圖3可知，隨濃度增加，地木耳多糖和提取液對超氧陰離子清除率增加。地木耳多糖對超氧陰離子清除作用強于地木耳提取液。蓬溪和名山地木耳多糖對超氧陰離子清除作用強于南部地木耳多糖。地木耳提取液在6.4 g/L時達到最大，為（54.29%±2.12%）。蓬溪和名山地木耳多糖對超氧陰離子清除率在6.4 g/L達到最大，分別為（84.21%±2.50%）和（77.78%±2.66）%；南部地木耳多糖對超氧陰離子清除率在6.4 g/L達到最大，為（69.57%±1.88%），比蓬溪和名山地木耳多糖低。VC在0.1 g/L時，對超氧陰離子清除率達到（97.75%±2.45）%。地木耳多糖對超氧陰離子清除率大于地木耳提取液，地木耳多糖與提取液對超氧陰離子清除率均低于VC。

2.3.3 清除羥基自由基能力的結果分析 由圖4可知，隨濃度增加，地木耳多糖與提取液對羥基自由基清除作用增加。地木耳多糖對羥基自由基清除作用強于地木耳提取液。蓬溪和名山地木耳多糖對羥基自由基清除作用強于南部地木耳多糖。地木耳提取液在6.4 g/L時達到最大，為（58.32%±1.92%）。蓬溪和名山地木耳多糖對羥基自由基清除率在6.4 g/L達到最大，分別為（88.94%±2.62%）和（84.32%± 2.67%）；南部地木耳多糖對羥基自由基清除率在6.4 g/L時達到最大，為（75.80%±2.24%），比蓬溪和名山地木耳多糖低。VC在0.1 g/L時，對羥基自由基清除率達到（94.69%±1.45%）。地木耳多糖對羥基自由基清除率大于地木耳提取液，地木耳多糖與提取液對羥基自由基清除率均低于VC對羥基自由基清除率。

2.3.4 地木耳多糖抗氧化活性的EC50值測定 由表2可知，地木耳多糖與提取液對DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基清除力的EC50值均較低，說明地木耳提取液和多糖具有較強的抗氧化活性。地木耳提取液對DPPH自由基、超氧陰離子和羥基自由基清除率的EC50值最高，南部地木耳多糖清除率的EC50值居中，蓬溪和名山地木耳多糖清除率的EC50值較低，說明蓬溪和名山地木耳多糖抗氧化作用最強，南部地木耳多糖抗氧化作用其次，地木耳提取液抗氧化作用最弱。

3 討論

生物體內代謝會產生自由基，正常情況下，體內抗氧化系統可清除自由基，但若機體代謝失衡，使機體內自由基過度積累就會造成DNA損傷、蛋白質和酶失活，從而給機體造成傷害，引起炎癥、衰老、心血管疾病及腫瘤的發生[8，19-21]。

蓬溪、名山、南部地木耳中多糖含量為16%～19%，比黃曉波等[22]報道的地木耳中多糖含量高；蓬溪和名山地木耳中多糖含量高于南部地木耳。對蓬溪、名山和南部地木耳多糖紅外光譜分析發現，3個地區地木耳多糖紅外光譜峰形和峰位置相似，但峰強度有差異，說明不同地區地木耳中多糖類型相似，但多糖含量有差異。

張唐偉等[9]報道地木耳多糖對DPPH自由基與羥基自由基具有較強的清除作用，而對超氧陰離子無效果；本研究結果表明，地木耳多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基清除作用強，二者之間有差異。不同地區地木耳多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基清除作用的差異與地木耳多糖的含量、組成與結構有關，這方面還有待進一步研究。

食藥用多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂、護肝排毒、促進核酸和蛋白質生物合成等多種生物功能[8]。地木耳多糖抗氧化活性研究有助于地木耳資源的綜合利用與開發。

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