基于微流控芯片的尿路感染細菌鑒定及抗生素敏感性測試

齊明月 杜燕 劉未平 陳斌 梁廣鐵 徐邦牢 劉大漁

摘 要 發展了一種微流控芯片紙基細菌分析技術，用于多重細菌鑒定與抗生素敏感性測試。制備了陣列培養池芯片，以濾紙作為襯底固定顯色培養基和抗生素。利用PVDF疏水薄膜止流閥，將尿液樣品引入芯片并分隔于不同培養池。借助于培養池陣列的空間分辨力，實現多重細菌分析。根據特異性顯色結果實現細菌鑒定，通過實時顯色強度分析實現細菌定量，依據抑制顯色反應的最低抗生素濃度確定抗生素敏感性。以3種泌尿系統感染常見病原菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌）為模擬測試對象進行分析，結果表明，芯片方法可以在18 h內實現對3種細菌的同時鑒定及6種抗生素敏感性測試。對照實驗顯示，芯片法與傳統方法細菌鑒定和抗生素敏感性測試結果一致性分別為94.1%和93.9%。本研究建立的微流控芯片細菌分析方法簡便快速，非常適合于醫療資源匱乏條件下的細菌分析。

關鍵詞 微流控芯片； 細菌鑒定； 抗生素敏感性測試； 快速檢測

1 引 言

尿路感染是非常常見的感染性疾病[1，2]，多由細菌引起，最常見的是大腸埃希菌，其次為糞腸球菌、銅綠假單胞菌、葡萄球菌屬細菌和肺炎克雷伯菌等[2]。尿路感染可引起局部和全身不適癥狀，嚴重者可導致腎功能衰竭，甚至感染性休克，因而需要及時診斷和治療。臨床治療尿路感染病例時，醫生需要了解病原菌的種類、數量以及對于抗生素的敏感性，以便進行針對性治療[3，4]。因此，臨床上的細菌檢測平臺，需具備多重病原菌快速定性與定量分析以及抗生素敏感性測試的功能。

傳統的尿路感染病原菌鑒定及抗生素敏感性試驗（Antibiotic susceptibility testing， AST）主要采用平板培養法，但是耗時較長（一般需2～3天）[5，6]，不利于及時診斷和抗生素選擇指導。近年開發出了尿路感染病原菌檢測新方法，如免疫熒光法[7]、干化學分析法[8]、流式細胞法[9]、聚合酶鏈式反應（PCR）[10]、質譜法[11]及新一代測序技術[12]等，雖然可以顯著縮短檢測時間，但這些方法大多依賴于大型或者精密設備，難以在基層醫療單位推廣。因此，亟需簡便、快速的尿路感染病原菌檢測方法。

近年發展起來的微流控芯片細菌分析技術[13～19]較之傳統方法具有很多優勢。首先，芯片細菌分析平臺小巧便攜，操作簡便，非常適合于現場快速檢測[20]；其次，芯片微分析平臺有利于提高測試通量和降低試樣消耗量[21]，便于實現高通量分析；此外，大多數芯片細菌分析方法可以免去預增菌步驟，因而可以顯著縮短分析時間[22]。因此，微流控芯片技術為細菌分析提供了一種理想的解決方案。然而，目前報道的微流控芯片細菌分析大多只針對單一種類細菌檢測[16，18，20]，無法滿足臨床上對病原菌的分析需求。

本研究組在前期工作[23]中進行了微流控芯片上多重細菌鑒定的初步探索。在此基礎上，本研究將多重細菌鑒定與AST結合，為芯片病原分析方法用于臨床診療奠定基礎。在芯片上進行多重細菌分析與AST，要求同步完成多重生化反應，因而需要解決包括多重試劑的引入、多重反應的有效分隔以及多重檢測指標的判定問題。針對上述問題，本研究發展了一種微流控芯片紙基細菌分析方法，在芯片培養池中以濾紙作為襯底組合固定菌種特異性顯色培養基和抗生素。濾紙成分為纖維素，具有疏松多孔結構，不僅具有良好的生物相容性， 而且易于固定試劑[24]。借助于芯片集成PVDF疏水薄膜止流閥，引入芯片的尿液樣品被分隔于不同培養池，以實現多重顯色反應。根據特異性顯色結果實現細菌定性鑒定，通過實時顯色強度分析實現細菌定量測定，依據抑制顯色反應的最低抗生素濃度確定抗生素敏感性，因此在芯片上實現了多重細菌的同時定性與定量分析和AST。本方法簡便快速，尤其適于醫療資源匱乏條件下的細菌快速分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TS2A四通道微量注射泵（保定蘭格公司）；XW80A漩渦振蕩器（上海書培公司）；尼康D7100數碼相機（日本尼康公司）；中速定性濾紙（杭州新華公司）；SU8 3035光刻膠（MicroChem公司）；聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）前體及引發劑（Dow Corning公司）；PVDF膜（孔徑0.23 μm，美國Millipore公司）；海藻酸鈉（上海生工公司）；系列抗生素（Sigma公司）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌特異性顯色培養基（青島海博公司）；血平板、營養瓊脂、MH肉湯培養基、營養肉湯培養基、McFarland 0.55.0 麥氏比濁管（廣東環凱公司）；金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸桿菌（ATCC25922）、糞腸球菌（ATCC29212）由本院檢驗科微生物室菌種保藏中心提供；尿路感染病人的尿液由本院檢驗科微生物室提供。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 微流控裝置

本實驗使用自行搭建的微型化細菌培養裝置 [23]。微流控芯片包含3層PDMS結構，采用軟刻蝕工藝加工[25]而成。芯片頂層包含一系列通孔，分別對應流體出入口以及培養池排氣孔（直徑1 mm），后者以PVDF膜封閉；芯片中間層含有一系列通孔（直徑3 mm），與底層無結構平板封接后形成培養池。培養池上游的折線形通道（長5.5 mm、寬0.05 mm）與進樣通道連接；培養池下游借助通道與頂層排氣孔連接。芯片各層經90℃烘烤2 h，紫外燈照射過夜。芯片封接在無菌條件下進行，先將中層與底層封接，然后將固定有特異性培養基及抗生素的紙片分別置于培養池中，等離子處理后將中層與頂層封接。最后，將PVDF膜借雙面膠貼附于排氣孔處，即制得完整芯片。

2.3 芯片上的實驗操作

將質控菌株取出后接種于血平板上，置37 ℃培養箱中培養，細菌進入指數生長期后收獲菌體。挑取數個菌落于無菌生理鹽水中混勻后測定濁度，調整濁度至0.5 MCF，相當于1.5 × 108 cfu/mL細菌濃度，系列稀釋后備用。臨床標本為采集的中段尿液，直接灌注入芯片。進樣時，通過微量注射泵向毛細管中吸入1 mL 細菌懸浮液，然后將毛細管與芯片進樣通道連接，并以50 μL/min 流量注入。待全部培養池充盈后，驅除多余菌液， 并向通道中快速灌入1.5%（w/V）海藻酸鈉溶液。進樣后將芯片置于便攜式培養裝置中，37℃培養18 h。

2.4 細菌增殖檢測

以金黃色葡萄球菌（ATCC25923）為例，比較芯片培養法與傳統肉湯培養法中的細菌增殖狀況。于0，2，4，6，8 和10 h 分別收獲兩組培養細菌菌液，用傾注平板法進行細菌計數，每2 h檢測一次細菌數量。

2.5 芯片上的細菌定性與定量分析

芯片細菌培養每隔30 min拍照一次，使用Photoshop軟件提取照片中培養池部位光密度值并描繪曲線。根據顯色反應顏色判定細菌種類，依據顯色時間確定細菌數量。設定培養池背景顏色強度偏差值3倍（3SD）為閾值，根據細菌顯色強度達到閾值所需時間（Time threshold，Tt值）推斷細菌初始濃度。

2.6 芯片上的細菌抗生素藥敏測試

根據針對細菌種類選擇抗生素，用于AST。對于金黃色葡萄球菌，選取紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、萬古霉素、慶大霉素、左氧氟沙星；對于大腸桿菌，選取亞胺培南、頭孢唑啉、氨芐青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素；對于糞腸球菌，選取紅霉素、克林霉素、四環素、氨芐青霉素、萬古霉素、左氧氟沙星。

3 結果與討論

3.1 微流控芯片設計

本研究所用的微流控裝置能夠為細菌生長提供適宜的溫度、濕度以及氧含量。培養池體積約為19 μL，容納11 μL顯色培養基及8 μL細菌懸液，可為細菌生長提供足夠的養分及空間。經培養后，根據培養基顯色反應顏色判定細菌種類，依據顯色時間確定細菌數量。本實驗所用微流控芯片含63個培養池，分別用于細菌鑒定與AST。因此，每張芯片可同時鑒定3種細菌，以及6種抗生素3個水平的AST。結合菌種特異性培養基的顏色分辨力及培養池陣列的空間分辨力，本方法可實現多重細菌的定性與定量分析和抗生素敏感性判定。

本研究在以濾紙作為襯底的培養池中實現細菌培養和顯色反應。濾紙具有疏松多孔結構，可以簡便地固定顯色培養基和抗生素。紙片封裝時，將固定有抗生素的紙片置于頂層，固定有瓊脂顯色培養基的紙片置于底層。樣品進入培養池時，由于紙片及瓊脂的阻滯效應，可有效防止灌液時抗生素被流體沖走。

為防止培養池中試劑交互干擾，設計了一種基于PVDF膜的止流閥（圖2）。初始狀態下芯片主通道阻力大于分支通道，可以保證流體優先經分支通道充盈培養池。培養池下游通道連接排氣口，后者以PVDF膜覆蓋。疏水性PVDF膜具有透氣特性，在液體充盈培養池過程中，允許氣體通過排氣口排出；而當液體接觸PVDF膜后，由于流動阻力顯著增加而無法通過。利用上述設計，樣品可以順序充滿一系列培養池，不會造成試劑的交叉污染。完成進樣后，主通道引入粘性的海藻酸鈉溶液封閉培養池入口，避免培養池間的交互影響。采用與抗生素分子質量相當的溴酚藍驗證芯片性能。溴酚藍為靈敏酸堿指示劑，低pH條件下呈黃色，遇堿則變藍。將固定溴酚藍的濾紙片與空白濾紙片相間封裝于培養池中，向芯片中灌入0.1% NaOH溶液，溴酚藍未擴散至相鄰的空白濾紙（圖3）。此結果表明，進樣過程中，芯片培養池中的試劑未發生交叉污染。

圖2 芯片操作步驟示意圖。芯片培養池上游的折線形通道與進樣通道連接， 下游通道與頂層排氣孔連接，后者使用PVDF膜覆蓋。進樣過程：Ⅰ. 樣品引入進樣通道。由于主通道與分支通道阻力差異，標本優先進入分支通道；Ⅱ. 當樣品接觸到PVDF膜，由于表面張力效應分支通道內阻力增加因而起到止流作用，樣品繼續充盈下游培養池；Ⅲ. 待全部培養池充盈后，驅除主通道殘留液體；Ⅳ. 主通道引入海藻酸鈉封閉培養池。

3.2 芯片上的細菌增殖

以金黃色葡萄球菌為例，比較了芯片培養方法與傳統肉湯培養方法中細菌的增殖情況。平板傾注法計數結果顯示，使用兩種方法培養的細菌在此階段均呈指數增殖狀態（圖4），細菌增殖率無顯著差異。

3.3 芯片上的細菌定性和定量分析

根據顯色培養基說明，經培養后，大腸桿菌顯粉紅色， 金黃色葡萄球菌顯藍綠色， 糞腸球菌顯黃色，如培養池中出現相應顏色則判定存在上述細菌。

由于環境中的細菌污染，健康人尿液樣品也可能存在少量細菌。因此，細菌的準確定量對于尿路感染診斷是非常重要的。參考臨床判定標準，如尿細菌密度≥105 /mL，判定為尿路感染；密度介于104～105/mL，為可疑陽性；如<104 /mL，判斷為污染。由于細菌初始數量與顯色時間存在相關性[26]，本研究發展了一種實時顯色強度定量方法，即根據Tt值推斷細菌初始數量。在芯片上分別接種系列濃度金黃色葡萄球菌，拍照結果顯示細菌顯色時間Tt值與初始細菌密度相關（圖5）。線性回歸分析顯示金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌的初始數量與Tt值均存在較好的線性關系（金黃色葡萄球菌R2=0.9576；大腸桿菌R2=0.9615；糞腸球菌R2=0.9464）。因此，依據Tt值可以推斷出初始細菌密度。

3.4 抗生素敏感性測試

目前，由于廣泛存在的細菌耐藥問題，AST對于個體化治療指導具有重要價值。本研究發展的芯片AST方法同樣依賴于顯色反應，其原理是足夠劑量的敏感抗生素通過抑制細菌生長使顯色反應呈現陰性。參照美國CLSI 對MIC（最小抑菌濃度）的解釋，使用敏感、中介和耐藥3個水平來解讀細菌對于某種抗生素的敏感度[27]。如圖6Ⅲ所示的大腸桿菌對于亞胺培南的敏感性測試，細菌對于該抗生素的敏感性依據最低的顯色抑制濃度判定。亞胺培南對大腸桿菌的MIC解釋標準中，敏感，中介、耐藥濃度轉折點分別為1，2和4 μg/mL。在抗生素（-）組顯色的前題下，如以上3個藥物濃度組均未顯色，則判定對該抗生素敏感；如1 μg/mL濃度組顯色，判定為中介；如1和2 μg/mL顯色， 或3個濃度組都顯色，判定為耐藥。同理判斷其它抗生素MIC（金黃色葡萄球菌對克林霉素見圖6Ⅰ，腸球菌對左氧氟沙星見圖6Ⅱ）。

3.5 臨床樣本分析

利用傳統方法與芯片方法平行測試40例臨床可疑尿液感染標本。傳統方法和芯片方法對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的陽性檢出例數分別為17例和16例，二者一致性為94.1%。由于本實驗使用的細菌特異性顯色培養基種類有限，芯片方法細菌鑒定僅限于3種細菌，因而總體陽性檢出率顯著低于對照方法（40% vs 80%），這需要在后續實驗中增加顯色培養基種類加以解決。對照常規方法檢測結果，證實芯片方法鑒定陰性樣品中待檢致病菌數量均低于103 cfu/mL，而鑒定為細菌（+）的尿液標本中致病菌數量多數在105 cfu/mL水平。對照實驗結果表明，芯片法與傳統方法AST結果的總體一致率為93.9%， 顯示兩種方法具有較好的一致性。其中，金黃色葡萄球菌與糞腸球菌AST結果一致率均為100%，而大腸桿菌的AST結果一致率稍低，為90.7%（表1），這種差異可能是由于大腸桿菌顯色反應定量偏差導致。

4 結 論

本研究發展了微流控芯片多重細菌鑒定和AST方法，具有操作簡便、耗時短、低消耗和高通量的優勢，適合于醫療資源匱乏條件下的細菌分析。后續工作將進一步擴展檢測對象范圍，以提高該技術的實際應用性能。

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Uropathogenic Bacteria Identification and Antibiotic

Susceptibility Testing on a Microfluidic Chip

QI MingYue1， DU Yan1， LIU WeiPing1， CHEN Bin1， LIANG GuangTie1，2，

XU BangLao*1，2， LIU DaYu1，2

1（Department of Laboratory Medicine， Guangzhou First People′s Hospital，

Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510180， China）

2 （Clinical Molecular Medicine and Molecular Diagnosis Key Laboratory of Guangdong Province， Guangzhou 510180， China）

Abstract A microfluidic chip assay was described for bacteria identification and antibiotic susceptibility test （AST）. Filter paper pads were embedded in arrayed microchambers， with immobilized antibiotics and chromogenic medium. By taking advantage of the polyvinylidene fluoride （PVDF） membrane based valves， urine sample introduced was distributed in individual chambers without cross contamination. The simultaneous analysis of multiple bacteria was achieved by using the culture chamber array design. The identification of a bacterium was based on its specific colorimetric result. The density of a bacterium was determined by realtime monitoring color intensity in the chamber， and its susceptibility to an antibiotic was determined relying on the lowest antibiotic concentration that inhibited the colorimetric reaction. A set of three common uropathogenic bacteria were selected as models to test the microfluidic approach. Our results showed that the developed microfluidic assay was able to complete bacteria identification and the sixantibiotic AST in 18 h. In comparison with the conventional method， the microchip method showed a coincidence of 94.1% and 93.9% with regard to bacteria identification and AST， respectively. The developed microfluidic approach is simple and rapid， thus hold the potential to serve as a powerful tool for bacterial analysis under conditions of poor medical resource.

Keywords Microfluidic chip； Bacterial identification； Antibiotic susceptibility testing； Rapid detection

（Received 14 January 2016； accepted 3 February 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 81371649， 81271730，81501831） and the Natural Science Foundation of Guangdong Province， China （No. 2014A030313677）