液相芯片技術同時檢測萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇

梁世正 潘家榮

摘 要 建立了一種同時檢測獸藥萊克多巴胺（RAC）、克倫特羅（CL）、沙丁胺醇（SAL）的多殘留的新方法。采用液相懸浮芯片技術，基于間接競爭法的原理，將3種獸藥抗原分別偶聯到不同的熒光微球上作為探針，以藻紅蛋白（PE）熒光標記二抗為信號，通過優化實驗條件，分別建立3種獸藥的標準曲線。基于特異性識別實驗，建立3種獸藥同時檢測的標準曲線。結果表明，同時檢測的3條曲線均呈現良好的線性相關，線性相關系數（R2）均大于0.99，RAC， CL和SAL的檢測范圍分別為1～500 μg/L， 0.1～500 μg/L， 1～100 μg/L，檢出限分別為0.68， 0.095和0.88 μg/L。與其它結構類似物的交叉反應率均低于1.5%，實際樣品中的加標回收率令人滿意。

關鍵詞 液相芯片技術；多殘留分析；萊克多巴胺；克倫特羅；沙丁胺醇

1 引 言

由于“瘦肉精”具有明顯的促生長、提高瘦肉率及減少脂肪的效果，近年來常發生違法使用“瘦肉精”事件[1]。非法添加的“瘦肉精”以萊克多巴胺（RAC）、克倫特羅（CL）、沙丁胺醇（SAL）較為常見，2012年中華人民共和國農業部1682號公告將其均列為“瘦肉精”，以加強監測?！笆萑饩辈粌H危害消費者身體健康，可引起中毒，嚴重者甚至可引起死亡，同時也被世界反興奮劑機構列為運動員禁用的興奮劑[2，3]。因此大力研發“瘦肉精”殘留檢測技術具有非常重要的現實意義。

現有RAC、CL和SAL等“瘦肉精”的快速檢測方法主要有酶聯免疫法[4，5]、膠體金法[6]、化學發光酶免疫法[7]、傳感器技術[8]、表面增強拉曼光譜技術[9]等，但上述方法通常只能針對一種物質檢測。文獻報道的多殘留檢測技術，也只針對這3種物質的總量測定[10，11]。在多殘留同時分析中，更多采用的是液相色譜法[ 12，13]、氣相色譜質譜聯用法[ 14]和液相色譜質譜聯用法[ 15，16]、毛細管電泳法[17]等，這些方法雖然靈敏度較高，但普遍存在樣品前處理復雜、耗時長的不足，在檢測樣品量較大時尤為突出。

液相芯片技術（Suspension array technology，SAT）是20世紀末開發的基于熒光微球的多功能分析平臺，也是唯一經美國食品與藥品管理局批準應用于臨床診斷的新型生物芯片產品[18]。它具有靈敏度高、檢測速度快、靈活性強的優點，可在2～3 h內對大量樣品的多種成分進行篩選分析，主要用于核酸和蛋白質檢測，如病原體檢測、核酸測定、細胞因子測定、腫瘤標記物測定等[19～22]?；谵r獸藥的抗原及抗體，也已經建立了農獸藥殘留液相芯片技術檢測方法[23～26]。然而，同時檢測這3種瘦肉精的研究尚未見報道。本研究結合液相芯片技術的優點，借鑒間接競爭酶聯免疫吸附分析法的原理，以藻紅蛋白標記二抗為報告分子，實現對RAC、CL和SAL同時快速檢測， 也為其它獸藥殘留的檢測提供了新思路。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Luminex 200液相懸浮芯片系統（美國Luminex公司）；4625型孔板振蕩器；ST16R冷凍離心機（美國Thermo公司）；WP6122050抽濾裝置（美國Millipore公司）。

編號No.18、No.20和No.29的微球（美國Luminex公司）；鹽酸萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅、硫酸沙丁胺醇、西馬特羅、馬布特羅、鹽酸齊帕特羅等標準品購自德國Dr. Ehrenstofer公司；牛血清蛋白BSA（美國Sigma公司）；1.2 μm 96孔過濾板（美國Millipore公司）；RAC、CL和SAL的抗原及其單克隆抗體購自中檢維康公司； PE標記二抗購自上海繪辛公司。其余試劑均為國產分析純；豬肉購自當地超市。

活化緩沖液：0.1 mol/L NaH2PO4Na2HPO4，pH 6.2。磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）：138 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，8 mmol/L Na2HPO4， 1.5 mmol/L KH2PO4。洗滌緩沖液：PBS，0.05% Tween20，pH 7.4。分析緩沖液：PBS，1% BSA，pH 7.4。儲存緩沖液：PBS，0.1% BSA，0.02% Tween20，0.05%疊氮化鈉，pH 7.4。

2.2 實驗方法

2.2.1 實驗原理 Luminex微球用熒光染料進行編碼，通過調節兩種熒光染料的配比獲得100種不同特征光譜的微球[27]。首先將3種瘦肉精抗原分別共價交聯到3種微球表面。類似間接競爭法原理，以微球為固相載體，樣品中的獸藥分子、微球上的獸藥抗原競爭結合獸藥抗體，再用抽濾方式除去未結合物質，結合上報告分子（PE熒光標記二抗）。懸浮芯片系統中有兩個激光發射器，紅色激光可以一次性激發熒光微球上的兩種熒光染料，熒光信號被兩個光電二極管所識別，根據熒光圖譜不同確定微球編號，進而確定微球上偶聯的探針，達到定性分析的目的；另一個激發報告分子，該熒光信號被光電倍增管識別，通過量化微球上結合的報告信號，即中位熒光強度值（Mean fluorescent intensity， MFI），實現定量分析，如圖1所示。

2.2.2 實驗步驟 （1）取出偶聯微球，恢復至室溫后漩渦30 s，超聲處理10 s。 （2）1.2 μm的96孔過濾板中加入100 μL PBS預濕實驗孔。抽去孔內液體，每孔中加入適量預混好的偶聯微球（每種約2000個），用150 μL PBS洗滌兩次后。將適量標準品或樣品分別加入合適的孔中，空白孔加入等量PBS，再加入適量的各種抗體，用PBS補齊各孔至100 μL。 （3）用移液器反復抽吸混勻孔內溶液，避光條件下37℃振蕩60 min。 （4）反應完畢后，抽去孔內液體，用150 μL PBS洗滌兩次。 （5）每孔中加入100 μL經適當稀釋的PE標記二抗，移液器反復抽吸混勻。 （6）避光條件下， 37℃振蕩45 min后，抽去孔內液體，用150 μL PBS洗滌兩次。 （7）加入100 μL PBS，重懸浮微球并混勻，置于液相芯片系統進行測試，每種微球讀取100個。

2.3 實驗條件優化以及標準曲線的建立

2.3.1 最佳抗原加入量 參照Luminex公司提供的蛋白質偶聯方法[23]并優化： 取微球100 μL（1.25×106個/mL）置于EP管，14000 g離心5 min，棄上清液。加入活化緩沖液，振蕩和超聲各30 s， 重懸，再加入50 mg/mL NHS和EDC各50 μL， 混勻， 37℃振蕩20 min。離心棄上清液， 用PBS洗滌3次，加入150 μL PBS重懸，再加入抗原，用PBS補齊至500 μL，37℃振蕩6 h。離心棄上清液后，用1% BSA封閉，儲存緩沖液保存?？乖尤肓糠謩e為1， 2， 4， 8和10 ng。其中，微球No.18， No.20， No.29分別偶聯RAC抗原、CL抗原和SAL抗原。

2.3.2 最佳抗體加入量 按照2.2.2節方法，在不加樣品和標準品情況下，分別加入對應抗體1， 5， 10， 20和40 ng，加入過量的PE標記二抗，采用液相芯片系統測試。

2.3.3 單一標準曲線建立 3種標準品按照一定比例稀釋成梯度液，采用液相芯片系統測試。按照ELISA所采用的抑制率計算方式（抑制率B =（A1-An）/A1，其中， A1為不加樣品孔MFI值； An為加標準品或者樣品孔MFI值），將各孔MFI值換算成抑制率，以抑制率為縱坐標，濃度的對數值為橫坐標，建立RAC， CL， SAL的單一標準曲線。

2.3.4 特異性識別實驗 參照文獻[28]的高通量檢測的特異性識別實驗方法，測試所制備的熒光微球表面的抗原是否能被各自的抗體特異性識別。按照2.2.2節實驗步驟，其中，1， 2， 3號孔分別加入偶聯抗原的微球No.18， No.20， No.29和對應的最佳抗體加入量，4號孔加入3種偶聯抗原的微球和對應的最佳抗體加入量。5， 6， 7號孔僅分別比1， 2， 3號孔多加入對應的過量標準品，8號則比4號多加入過量的3種標準品。8個孔均加入適當PE標記二抗反應后，采用液相芯片系統測試。

2.3.5 多元標準曲線建立 將3種偶聯微球等數量混合后，按照2.2.2節，每孔加入偶聯好微球混合液（每種微球約2000個），再加入按照一定比例稀釋的3種標準品，采用液相芯片系統測試。

2.4 交叉反應性

分別對RAC、CL、SAL、西馬特羅、馬布特羅和鹽酸齊帕特羅進行交叉反應性測試，以結構類似物濃度對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標，建立標準曲線，計算IC50，按照交叉反應率公式[29]（交叉反應率為目標物IC50與結構類似物IC50的百分比）計算結果。

2.5 加標回收實驗

參照文獻[30]的樣品前處理方法，在已知量的豬肉組織樣品中，加入標準品后充分絞碎；準確稱取2.0 g，加入6 mL乙腈0.1 mol/L HCl（84∶16， V/V）， 振蕩離心；用正己烷萃取3次后旋蒸至近干，用純水定容至1 mL。分別測試添加濃度為1， 5， 10和50 ng/g的RAC， CL和SAL單標和混標時的回收率。

3 結果與討論

3.1 抗原加入量優化

如圖2所示，起初隨著抗原加入量增加，MFI值逐漸升高，這是因為微球表面上的位點越來越多地被抗原占據。隨后，隨著抗原加入量增加時，MFI值反而降低，這可能是由于微球表面結合過多抗原，形成空間位阻，不利于抗體的結合[23]。以MFI最高時的抗原量為最佳加入量，即SAL， CL， RAC分別為2， 4和4 μg。

3.2 抗體加入量優化

如圖3所示，低濃度時，隨著抗體加入量增加，MFI值迅速升高?？贵w量增大一定值后， 3種抗體的

MFI值均趨于平穩，此時獸藥抗原的位點已被全部占據[23]。選擇MFI的拐點為最佳抗體加入量，因為

此時靶標物和探針競爭結合獸藥抗體的競爭結果變化最顯著，同時考慮節省抗體，SAL， CL和RAC的

抗體加入量分別為10， 20和5 ng。

3.3 一元標準曲線建立

在最佳實驗條件下，建立了3種瘦肉精的一元標準曲線。在一定濃度范圍內，抑制率與3種瘦肉精濃度呈現良好的線性關系。 RAC（圖4A）的線性方程為y=0.2733x+0.1933，R2=0.9933，線性范圍0.5～500 ng/mL，IC10=0.456 ng/mL。CL（圖4B）的線性方程為y=0.1881x+0.2929，R2=0.9961，線性范圍0.1～100 ng/mL，IC10=0.094 ng/mL。SAL（圖4C）的線性方程為y=0.3376x+0.1302，R2=0.9943，線性范圍為1～500 ng/mL，IC10=0.814 ng/mL。3種獸藥的檢出限均低于1 ng/mL，表現出較高的靈敏度。

圖4 檢測萊克多巴胺（A）、 克倫特羅（B）和沙丁胺醇（C）的一元標準曲線

Fig.4 Standard curves for detection of RAC （A）， CL （B） and SAL （C）

3.4 特異性識別實驗

特異性識別實驗結果如圖5所示，利用軟件SPSS19的單樣本t檢驗方法對數據進行分析。4號孔的No.18， No.20， No.29的MFI分別與1， 2， 3號孔的MFI對比，p>0.05，無顯著性差異，說明各獸藥抗體均能特異性識別其對應微球上的獸藥抗原，而與其它獸藥抗原無明顯交叉反應。同樣， 8號孔與5， 6， 7號孔對比，p>0.05，無顯著性差異，說明在競爭條件下，獸藥仍能特異性識別對應微球上的獸藥抗原，而不會干擾其它獸藥抗體與對應微球上的獸藥微球結合。而4號孔與8號孔對比，p<0.05，差異性顯著，說明加入標準品后，標準品能與微球上的獸藥抗原顯著競爭獸藥抗體。以上結果表明，在混合體系中，3種抗體均能準確特異性識別各自的探針，各抗體與其它探針和標準品幾乎不結合，無明顯干擾，因此，可以實現RAC， CL和SAL的多元分析。

3.5 多元標準曲線建立

以抑制率為縱坐標，標準物濃度對數值為橫坐標，建立多元標準曲線，如圖6所示。3條曲線的參數如表1所示，R2﹥0.99，但略小于單一標準曲線，檢測范圍及檢出限均也均有細小差別。一方面，目

標物增加后，反應體系變得更復雜，雖然3種目標物同時檢測時無明顯干擾，但微小的干擾仍難以避免。此外，3種物質均為β2受體激動劑，結構相似，存在極低的交叉反應率，會影響檢測范圍及檢出限。與進出口標準中RAC， CL， SAL的檢出限（分別為0.5， 0.05和0.5μg/kg）相比[31]，本分析方法靈敏度高，檢測范圍更寬。

3.6 回收率

RAC， CL和SAL的添加濃度均為1， 5， 10和50 ng/g時，分別測試豬肉樣品中3種物質的回收率，結果見表2和表3?？梢妼τ趩螛撕突鞓藰悠?，添加回收率均在80%～115%之間。

3.7 交叉反應測試

分別對RAC、CL、SAL、西馬特羅、馬布特羅和鹽酸齊帕特羅進行測試，結果如表4所示，對所測的幾種結構類似物的交叉反應率均低于1.5%，表明本方法交叉反應率低，特異性強，可用于RAC， CL， SAL多殘留檢測。

4 結 論

研究結果表明，本方法具有通量高、靈敏度高、特異性強、檢測速度快的優點，實現了RAC， CL和SAL的多殘留分析，為研制多殘留檢測的商業化試劑盒奠定了基礎。

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