桃上蘋果褪綠葉斑病毒的發(fā)生與檢測

王海榮　劉偉　安淼　董曉民　余賢美

摘要：對山東省果樹研究所試驗基地‘玉妃、‘超紅、‘岱妃三個桃品種的蘋果褪綠葉斑病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，采集22份樣品，利用ACLSV特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果表明，在‘玉妃桃的葉片中擴(kuò)增出與蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）預(yù)期大小一致的目的片段，并與Gen-Bank登錄的病毒核苷酸序列具有較高的一致性，而在‘超紅和‘岱妃桃中均未檢測到該病毒。

關(guān)鍵詞：桃；蘋果褪綠葉斑病毒；病原檢測

中圖分類號：S436.621.1⁺9 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0109-03

桃（Prunus persica L.）為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）桃亞屬（Amygdalus）多年生中型喬木，在我國有著悠久的栽培歷史。近年來，桃樹栽培面積不斷擴(kuò)大，以及栽培中苗木引種和調(diào)運、無性繁殖代數(shù)增多等因素，加快了桃病毒病的傳播和發(fā)生，極大地影響了桃樹的經(jīng)濟(jì)價值。蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV）屬于潛隱性病毒，寄主范圍和分布較廣，能侵染多種果樹，在世界各國均有發(fā)生。桃感染該病后，葉片上出現(xiàn)深綠光點或波浪狀斑，該癥狀稱為桃深綠光點斑駁，在溫室比大田更為明顯。某些品種感病后會引起不親和現(xiàn)象，如果用李作砧木，在6～8年后出現(xiàn)親和力不強現(xiàn)象，嫁接口壞死樹體衰弱。本研究中筆者對‘玉妃、‘超紅、‘岱妃三個桃新品種進(jìn)行蘋果褪綠葉斑病毒檢測，為下一步建立無毒桃繁殖體系和培育桃優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 供試3個桃品種（‘玉妃、‘超紅、‘岱妃）于2014年9月取自山東省果樹研究所桃試驗基地（泰安）。每棵樹采集10個枝條作為一個樣品，隨機(jī)采集有疑似病毒病和無發(fā)病癥狀的幼嫩部位枝條，裝入塑料袋，編號標(biāo)記后立即放人冰盒，帶回實驗室取葉片作為待測物。其中，‘玉妃桃采集10棵樹，編號分別為YF1～YF10；‘超紅桃采集10棵樹，編號分別為CH1～CH10；‘岱妃桃采集2棵樹，編號分別為DF1、DF2。

1.1.2 主要試劑 TRNzol Reagemt，購自北京天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購自Axygen試劑公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 參考用TRIzol法提取桃葉片總RNA，得到的RNA溶液保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.2 引物設(shè)計 用于檢測蘋果褪綠葉斑病毒的引物序列為ACLSV-F（5-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3）和ACLSV-R（5-GTCTACAG-GCTATTTATTATAAG-3）。

1.2.3 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄：在1.5mL離心管中加入RNA模板1μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，5×M-MLVbuffer2μL，20μmol/L6-Rad0.5μL，20μmol/LOligo（dT）0.5μL，40U/μLRNaseinhibitor0.5μL，200U/μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，加ddH₂O至總體積為10μL。25℃放置10min，42℃放置1h，冰浴2min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增：PCR體系為2×TaqPCRMaster-mix7.5μL，20μmol/LR-primer和20μmol/LF-primer各0.5μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，加ddH₂O至總體積為15μL，充分混勻后置于PCR儀中。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析 PCR產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化和克隆篩選：按試劑盒操作指南，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，分別將純化產(chǎn)物連接至pGEM-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸感菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選單菌落置于1mLLB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）中培養(yǎng)，通過菌液PCR檢測來鑒定重組質(zhì)粒。

目的片段的序列測定和分析：經(jīng)菌液PCR，篩選3個陽性菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。通過BLAST數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索目的片段的同源序列，并用DNAMAN軟件對蘋果褪綠葉斑病毒的基因片段序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

以不同品種桃葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后連接至pGEM-T，克隆測序。結(jié)果（圖1）顯示，從‘玉妃桃樣品YF2、YF7、YF10中可擴(kuò)增得到800bp的特異片段，與預(yù)期產(chǎn)物大小相同，與GenBank中已報道的ACLSV分離物的核苷酸序列（登錄號NC001409）一致性為96%，檢出率為13.64%。

3 結(jié)論與討論

我國有豐富的桃品種資源，種植廣泛。病毒病的發(fā)生一直是影響我國桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要原因之一，進(jìn)行病毒檢測是建立無病毒苗木繁殖的必要條件。本研究對山東省果樹研究所桃試驗基地（泰安）3個桃品種的蘋果褪綠葉斑病毒的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：從3株‘玉妃桃（YF2、YF7、YF10）中檢測到該病毒，檢出率為13.64%。

蘋果褪綠葉斑病毒在桃樹上一直有著較高的發(fā)病率。阮小鳳等（1998）對陜西省桃主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況的調(diào)查和檢測結(jié)果顯示，ACLSV的發(fā)生較普遍，單獨感染率為15.8%，與各種病毒的混合感染都有出現(xiàn)；牛飛慶（2012）從我國12個省的417份桃樹樣品中檢測出ACLSV的帶毒率為20%；于云（2013）從我國12個省的505份桃樹樣品中檢測到ACLSV、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（CGRMV）、李屬壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）、杏假褪綠葉斑病毒（APCLSV），其中ACLSV的感染率最高達(dá)71.8%，而且山東省的病毒發(fā)生率高達(dá)58.3%。總之，不同地區(qū)桃樹的病毒病發(fā)生情況與繁殖用苗帶毒與否有很大關(guān)系，一旦繁殖材料帶毒，就會加快桃樹病毒病的傳播蔓延，所以使用無病毒繁殖材料和選擇抗性強的桃樹品種是預(yù)防桃病毒病的重要手段。本試驗只在‘玉妃桃上檢測到ACLSV，表明‘超紅和‘岱妃有著相對強的抗病性。由于本試驗檢測的樣品數(shù)量有限，還無法確定該病毒在本地區(qū)的分布情況，仍需進(jìn)一步調(diào)查研究。