板栗褐緣葉枯病病原菌協(xié)同致病菌

張秀停　趙洋民　王慶華　龔賽　姜淑霞

摘要：對(duì)板栗擬莖點(diǎn)霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae協(xié)同致病菌Ophiognomonia castanea的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，O.castanea菌絲在馬鈴薯一板栗葉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為15～28℃，最適溫度為25℃，最適pH為6；最適宜碳源為甘露醇，氮源蛋白胨和牛肉浸膏能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：Ophiognomonia castanea；生物學(xué)特性；菌絲生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)：S436.64 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）04-0090-04

板栗褐緣葉枯病是近年來(lái)在山東板栗產(chǎn)區(qū)發(fā)生的一種新病害，其病原菌為板栗擬莖點(diǎn)霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae。在對(duì)板栗褐緣葉枯病的研究中發(fā)現(xiàn)，該病斑上還寄生一種Pphiognomonia屬真菌Ophiognomonia castanea。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)Ophiognomonia屬真菌的研究很少，對(duì)O.castanea的研究更未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)O.castanea的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并比較了與P.castaneae-mollissima生物學(xué)特性的差異，探討兩菌株的生長(zhǎng)及致病關(guān)系，以期對(duì)板栗褐緣葉枯病的防治提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)生板栗褐緣葉枯病的板栗葉片，采自山東省泰安市徂徠山林場(chǎng)光華寺林區(qū)。供試O.casta-nea菌株為病斑組織分離純化的菌絲，經(jīng)單菌絲萌發(fā)獲得的純菌落，保存于4℃冰箱中備用。

1.2 研究方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)O.castallga菌絲生長(zhǎng)的影響 選用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL）、馬鈴薯一玉米粉培養(yǎng)基（馬鈴薯100g，玉米粉20g，瓊脂20g，水1000mL）、馬鈴薯綜合培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，瓊脂20g，水1000mL）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（玉米粉50g，瓊脂20g，水1000mL）、馬鈴薯-板栗葉培養(yǎng)基（馬鈴薯100g，板栗葉20g，葡萄糖20g，水1000mL）、板栗葉培養(yǎng)基（板栗葉20g，葡萄糖4g，玉米粉4g，瓊脂16g，水1000mL）。在供試菌株的菌落邊緣取直徑5mm菌餅，移植到培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)，于接種后的第4、7、10、14d用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每處理重復(fù)5次。

1.2.2 不同碳源對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以2%葡萄糖為碳源，分別以相同含碳量的淀粉、蔗糖、甘油、甘露醇、麥芽糖、木糖、果糖替換葡萄糖，配制成含有不同碳源的培養(yǎng)基。其他方法同1.2.1。

1.2.3 不同氮源對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA培養(yǎng)基為對(duì)照培養(yǎng)基，以3%硝酸鈉為氮源，并以相同含氮量的蛋白胨、甘氨酸、氯化銨、尿素、天冬酰胺、牛肉膏、尿素，配制成含有不同氮源的培養(yǎng)基。其他方法同1.2.1。

1.2.4 不同溫度對(duì)O.castallga菌絲生長(zhǎng)的影響 在供試菌株的菌落邊緣取直徑5mm菌餅，移植到PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于5、15、20、25、28、30、35℃等7個(gè)不同溫度梯度下培養(yǎng)。其他方法同1.2.1。

1.2.5 不同pH值對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響 將PDA培養(yǎng)基用滅菌的NaOH溶液和HCl溶液分別調(diào)pH值至3、4、5、6、7、8、9。其他方法同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，馬鈴薯一板栗葉、馬鈴薯一玉米粉、PDA、馬鈴薯綜合、玉米粉瓊脂和板栗葉培養(yǎng)基14d平均直徑分別為3.43、2.85、2.41、1.64、1.62cm和1.44cm。馬鈴薯一板栗葉培養(yǎng)基長(zhǎng)速顯著快于其他培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)旺盛，濃白，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，但菌落略顯薄，菌絲較稀疏；馬鈴薯一玉米粉培養(yǎng)基菌落較厚，菌絲粗壯，基生菌絲發(fā)達(dá)，氣生菌絲不發(fā)達(dá)；PDA培養(yǎng)基菌落較厚，菌絲粗壯，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛；馬鈴薯綜合、玉米瓊脂和板栗葉培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)均較慢。

2.2 不同碳源對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響

在8種不同碳源的培養(yǎng)基上，以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最好，生長(zhǎng)快，菌落厚、致密，菌落邊緣濃白，生長(zhǎng)旺盛，中部淡黃色；麥芽糖培養(yǎng)基次之。在果糖、木糖培養(yǎng)基上，菌落較厚，菌絲生長(zhǎng)旺盛，但菌落邊緣不整齊，部分菌絲易老化變成淡黃色，菌絲短呈絨毛狀，生長(zhǎng)緩慢，部分菌落邊沿呈黃棕色；在甘油、淀粉培養(yǎng)基上，菌落白色至淡黃色，略薄，老化現(xiàn)象明顯；在葡萄糖、蔗糖培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)最差，菌絲老化嚴(yán)重，菌落均較小、薄，菌絲淡黃色短絨毛狀，菌落邊沿黃棕色（圖2）。

2.3 不同氮源對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響

蛋白胨培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度快，菌落致密、厚，菌絲白色，生長(zhǎng)旺盛，為最適氮源；牛肉浸膏次之。在硝酸鈉培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)較快，菌落初期濃白致密，但后期氣生菌絲徒長(zhǎng)，菌絲細(xì)弱，菌落邊沿薄；在對(duì)照、氯化銨、天冬酰胺和甘氨酸培養(yǎng)基上菌落較致密，菌絲白色至淡黃色，菌絲老化明顯，菌落形狀不規(guī)則。與對(duì)照相比，加入氮源蛋白胨、牛肉浸膏可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，而加入氮源氯化銨、天冬酰胺、硝酸鈉、甘氨酸則抑制菌絲生長(zhǎng)。以尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌絲不生長(zhǎng)。

2.4 不同溫度對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在15～28℃的溫度范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，25℃時(shí)生長(zhǎng)最快，且菌落最厚，菌絲濃密，生長(zhǎng)旺盛。28℃以上生長(zhǎng)緩慢，5℃和35℃時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)（圖4），表明該菌適宜相對(duì)中溫偏低的環(huán)境。

2.5 不同pH值對(duì)O.castanea菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在pH值5～8的PDA培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，以pH值6生長(zhǎng)最好，菌落致密，生長(zhǎng)速度最快，菌絲濃白。在pH值為5、7、8的培養(yǎng)基中，菌絲生長(zhǎng)較快，菌落略薄，菌絲老化明顯，菌落形狀不規(guī)則。當(dāng)pH值在3以下時(shí)，菌絲基本不能生長(zhǎng)。pH值為9時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢（圖5）。

3 結(jié)論與討論

對(duì)菌株O.castanea生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，菌絲在馬鈴薯一板栗葉、馬鈴薯一玉米粉、PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，以馬鈴薯一板栗葉培養(yǎng)基最為合適；適宜碳源為甘露醇和麥芽糖，以甘露醇為最佳；蛋白胨和牛肉浸膏能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，促進(jìn)作用最明顯的是蛋白胨。菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為15～28℃，最適溫度為25℃。菌絲在pH為4～9的PDA培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，最適pH為6。

自然條件下在夏末秋初O.castanea的菌絲出現(xiàn)在病斑上，此后發(fā)生量逐漸增多，直至11月，在這一時(shí)期氣溫相對(duì)適宜，有利于菌絲生長(zhǎng)，這一現(xiàn)象與O.castanea菌絲適宜溫度為15～28℃這一測(cè)定結(jié)果是一致的。在自然界只能在板栗褐緣葉枯病病斑擴(kuò)展到一定大小時(shí)才能在其病健交界處分離到O.castanea，O.castanea和P.castaneae-mollissimae具有協(xié)同侵染的特性。姜淑霞等曾測(cè)出板栗褐緣葉枯病病原菌P.castaneae-mollis-simae的適宜溫度范圍為20～30℃，適宜pH范圍為5～6。室內(nèi)測(cè)定，適宜O.castanea菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍比P.castaneae-mollissimae的低，并且二者最適pH值相同，也證實(shí)了兩菌在同一時(shí)間內(nèi)共同生長(zhǎng)在同一病斑上的自然現(xiàn)象。

在O.castanea菌絲的生物學(xué)特性試驗(yàn)中，不同處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)后一些菌落會(huì)出現(xiàn)白色、黃色兩種菌絲，白色菌絲生長(zhǎng)較快，黃色菌絲生長(zhǎng)緩慢，甚至不再生長(zhǎng)，邊沿黃棕色，兩種菌絲生長(zhǎng)速度不一，造成菌落形狀不規(guī)則。分析認(rèn)為，白色菌絲為正常菌絲，菌絲老化后產(chǎn)生淡黃色色素使菌絲發(fā)黃并且可以抑制菌絲的生長(zhǎng)。