蘿卜離體再生體系的建立

黃俊豪　徐文玲　劉賢嫻　劉辰　王淑芬　楊建平

摘要：以8種不同基因型的蘿卜為試驗(yàn)材料進(jìn)行帶柄子葉離體培養(yǎng)，篩選誘導(dǎo)不定芽和不定根的最佳培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明：喜諾曉青和翠綠蘿卜具有高頻再生潛力，由其帶柄子葉誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為：Ms培養(yǎng)基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA，誘導(dǎo)不定根的最佳培養(yǎng)基為：Ms培養(yǎng)基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA。

關(guān)鍵詞：蘿卜；愈傷組織；不定芽；不定根；激素

中圖分類號(hào)：S631.104⁺.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）04-0021-03

蘿卜（Raphanus sativus L.）又名萊菔，是十字花科蘿卜屬的二年生草本植物。作為一種以肉質(zhì)根為主要食用部位的蔬菜作物，蘿卜深受廣大群眾喜愛(ài)，在我國(guó)南北各地普遍栽培。隨著生活水平的提高，人們對(duì)蘿卜品質(zhì)的要求也日益增長(zhǎng)，這就對(duì)盡快育成優(yōu)質(zhì)抗病的蘿卜新品種提出了迫切要求。建立高效的離體再生體系是親本無(wú)性快繁和基因工程育種的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，然而蘿卜一直以來(lái)被認(rèn)為是一種再生頑拗型植物，再生難度大、廣泛適應(yīng)性不強(qiáng)。本試驗(yàn)選用不同基因型蘿卜為材料，從培育無(wú)菌苗到誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽、不定根，再到最后煉苗移栽，擬建立起完整的具有廣泛適應(yīng)性的蘿卜離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

濰縣青、青圓脆、滿堂紅、沙窩青、堤?hào)|、花葉紅玉春、喜諾曉青和翠綠蘿卜8個(gè)蘿卜品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗培育 將蘿卜種子于超凈工作臺(tái)上用75%酒精處理30s，再用4%次氯酸鈉溶液滅菌3min，最后用蒸餾水沖洗3遍，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，室溫25℃、光照時(shí)間16h·d^-1條件下培養(yǎng)，得到無(wú)菌苗。

1.2.2 愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo) 取生長(zhǎng)3～5d的無(wú)菌苗，切取子葉，留葉柄并將生長(zhǎng)點(diǎn)去除干凈，接種于不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，在室溫25℃、光照時(shí)間16h·d^-1條件下培養(yǎng)15～20d，統(tǒng)計(jì)愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率。通過(guò)記錄每種培養(yǎng)基內(nèi)蘿卜帶柄子葉的再生情況，確定適宜的愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)激素配比和誘導(dǎo)天數(shù)。

1.2.3 不定根的誘導(dǎo) 取誘導(dǎo)出的不定芽，接種于不同激素配比的MS培養(yǎng)基上，在室溫25℃、光照時(shí)間16h·d^-1條件下培養(yǎng)15～20d，統(tǒng)計(jì)不定根誘導(dǎo)率。通過(guò)記錄每種培養(yǎng)基內(nèi)不定芽的生根情況，確定適宜的不定根誘導(dǎo)激素配比和誘導(dǎo)天數(shù)。

1.2.4 煉苗移栽 將不定根誘導(dǎo)成功的再生植株培養(yǎng)瓶的蓋子揭開(kāi)，注意適當(dāng)保濕，使再生苗的生長(zhǎng)環(huán)境接近于田間，進(jìn)行煉苗培養(yǎng)。2～3d后將再生苗移栽于營(yíng)養(yǎng)缽中，于煉苗室內(nèi)緩苗培養(yǎng)15d左右，再移栽到大田中。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

以MS培養(yǎng)基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+不同配比激素，在pH5.7左右誘導(dǎo)蘿卜帶柄子葉再生愈傷組織效果明顯，8個(gè)蘿卜品種分別經(jīng)由2，4-D、IBA和NAA配合6-BA均能誘導(dǎo)出愈傷，其中，2，4-D配合6-BA誘導(dǎo)愈傷組織的效果最佳（表1）。

雖然8個(gè)蘿卜品種的帶柄子葉均誘導(dǎo)形成了愈傷組織，但是愈傷進(jìn)一步分化形成不定芽卻極其困難。在各種激素的誘導(dǎo)下，愈傷組織極易先生根，卻難以誘導(dǎo)出芽，僅喜諾曉青和翠綠蘿卜在NAA配合6-BA誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不僅再生出了愈傷組織，還再生出了不定芽，但誘導(dǎo)率卻很低。

2.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的進(jìn)一步篩選

以喜諾曉青和翠綠蘿卜為試材，進(jìn)一步細(xì)化NAA和6-BA激素配比進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)隨激素濃度的增加，蘿卜不定芽誘導(dǎo)率有先增加后降低的趨勢(shì)（表2）。6-BA和NAA濃度比值為100時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率較高，比值過(guò)高或過(guò)低會(huì)導(dǎo)致不定芽的誘導(dǎo)率下降。綜合比較，5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA對(duì)于喜諾曉青和翠綠蘿卜誘導(dǎo)不定芽較適宜。翠綠的不定芽誘導(dǎo)率明顯高于喜諾曉青，說(shuō)明翠綠的基因型易再生培養(yǎng)。

2.3 不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

在誘導(dǎo)不定芽的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步試驗(yàn)不同濃度6-BA與NAA配比對(duì)喜諾曉青和翠綠蘿卜不定根再生的影響，發(fā)現(xiàn)不定根的誘導(dǎo)與NAA濃度密切相關(guān)，NAA濃度過(guò)低時(shí)無(wú)法生成不定根，而NAA濃度過(guò)高時(shí)，生根率也會(huì)降低。總體來(lái)看，以5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA對(duì)于喜諾曉青和翠綠蘿卜誘導(dǎo)不定根比較適宜（表3）。翠綠比喜諾曉青更易于再生出不定根，說(shuō)明易于誘導(dǎo)出不定芽的基因型也同樣適宜進(jìn)一步誘導(dǎo)不定根，蘿卜的再生頻率高低和其基因型密切相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，不定芽有通過(guò)外植體直接誘導(dǎo)出芽和經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)出芽?jī)煞N途徑，2，4-D、IBA和NAA配合6-BA誘導(dǎo)愈傷組織、再經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)出芽在番茄、黃瓜等蔬菜作物中均有報(bào)道。關(guān)于蘿卜的離體培養(yǎng)，僅有誘導(dǎo)出愈傷組織和直接誘導(dǎo)出不定芽的報(bào)道，并沒(méi)有從愈傷組織再誘導(dǎo)出芽的報(bào)道，所以，蘿卜離體再生誘導(dǎo)的關(guān)鍵是直接誘導(dǎo)不定芽的分化和增殖。

本試驗(yàn)選用濰縣青、青圓脆、滿堂紅、沙窩青、堤?hào)|、花葉紅玉春、喜諾曉青和翠綠共8份試驗(yàn)材料，多數(shù)材料僅能再生出愈傷組織，難以進(jìn)一步分化再生出不定芽，其中僅有喜諾曉青和翠綠蘿卜誘導(dǎo)出了不定芽并進(jìn)而形成不定根。說(shuō)明蘿卜的再生能力較弱，其再生能力在不同基因型間差異十分顯著。

外植體的選擇也是影響蘿卜再生誘導(dǎo)效果的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)初期選用了下胚軸、子葉、子葉橫切、子葉縱切和帶柄子葉這幾種外植體材料，其中再生效果最差的是下胚軸，效果最好的是帶柄子葉，所以后期試驗(yàn)都采用帶柄子葉作為外植體。本研究發(fā)現(xiàn)蘿卜帶柄子葉離體培養(yǎng)的再生方式相對(duì)特殊，在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中先是子葉葉柄基部膨大產(chǎn)生少量愈傷組織后再生成大量不定芽，若外植體接種后產(chǎn)生大量愈傷組織就不能有效產(chǎn)生不定芽，說(shuō)明誘導(dǎo)愈傷組織的多少對(duì)不定芽再生有重要影響，這可能與其再生頑拗有所關(guān)聯(lián)，關(guān)于產(chǎn)生愈傷組織的多少對(duì)于有效誘導(dǎo)不定芽的影響機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

生長(zhǎng)激素的配比也是植物再生至關(guān)重要的因素，不同的植物對(duì)生長(zhǎng)激素有不同的要求。本試驗(yàn)在MS培養(yǎng)基中分別添加2，4-D、IBA、NAA和6-BA，最終發(fā)現(xiàn)僅有NAA配合6-BA能夠直接誘導(dǎo)蘿卜帶柄子葉生成不定芽和不定根。通過(guò)多組試驗(yàn)，確定其誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.05mg·L^-1NAA，誘導(dǎo)不定根的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+30g·L^-1蔗糖+0.7%瓊脂+5mg·L^-16-BA+0.10mg·L^-1NAA。