化學發光法與酶聯免疫吸附法進行血HIV檢測效果評價

段美婷　蘭良子

[摘 要] 目的：比較化學發光法與酶聯免疫吸附法在血液HIV檢測中的應用效果。方法 ：對本院2014年 3月至 2015年 9月期間所有術前檢查病人利用化學發光法和酶聯免疫吸附法進行HIV篩查試驗檢測。結果：35420例病人血清標本中，化學發光法和酶聯免疫吸附法均判定陽性29例，金標準免疫印跡法（WB）確定25例為陽性，4例為陰性。化學發光法陽性酶聯免疫吸附法陰性的10例，WB檢測結果陽性8例，陰性2例。化學發光法比酶聯免疫吸附法真陽性率高，但是假陽性率也增加。通過對比S/CO不同值，發現化學發光法假陽性率出現在S/CO≤500，并且隨著S/CO值降低，假陽性率升高明顯；S/CO>500，化學發光法準確性明顯升高。結論與酶聯免疫吸附法相比，在一定范圍內，化學發光法更適用血液HIV篩查。

[關鍵詞] 化學發光法；酶聯免疫吸附法；人類免疫缺陷病毒

中圖分類號：R446 文獻標識碼：B 文章編號：2095-5200（2016）05-078-03

[Abstract] Objective： To compare the application effects of chemical luminescence method method and enzyme-linked immunosorbent assay on the detection of HIV in blood. Methods： All patients in our hospital from March 2014 to September 2015 were examined by using chemiluminescence and enzyme-linked immunosorbent assay for HIV screening test. Results： In 35420 cases of serum samples， 29 cases were both positive through the methods of chemiluminescence and enzyme-linked immunosorbent assay， and the gold standard Western blotting （WB） confirmed that 25 cases were positive and 4 cases were negative. 10 cases were tested for positive through chemical luminescence method method but for negative through enzyme linked immunosorbent assay， and its WB test results were positive in 8 cases， negative in 2 cases. The true positive rate of chemical luminescence method method was higher than that of enzyme-linked immunosorbent assay， but the false positive rate was also increased. Through the comparison of different S/CO values， we found that the false positive rate of using chemical luminescence method method occurred as S/CO≤500， and with the decrease of S/CO value， false positive rate increased significantly； as S/CO>500， the accuracy of chemical luminescence method increased significantly. Conclusions： Compared with the enzyme-linked immunosorbent assay in a certain range， the chemical luminescence method is more suitable for HIV screening in blood.

[Key words] CLIA； Elisa； HIV

獲得性免疫缺乏綜合征簡稱艾滋病（AIDS），是由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）引起的一種嚴重傳染性疾病。酶聯免疫吸附法（Elisa）最早應用于艾滋病毒的篩查，1985年研制成功的第一代HIV Elisa試劑[2]敏感性和特異性欠佳，至今已發展至第四代。Gag基因編碼HIV病毒核心蛋白包括p17、p24、p15[3-7]，P24在血清轉換的很短時期內就可以被第四代試劑檢測出來，因此第四代HIV Elisa試劑將檢測的“窗口期”從三代的22天左右減少到16天左右[8]。

化學發光法（CLIA）的主要原理[9]是將酶免疫發光物質標記在抗原或抗體上，加入氧化劑或酶底物而發光，通過標準曲線測定發光強度來確定待測物的含量。本實驗將化學發光法和酶聯免疫吸附法兩種檢測方法進行對比評價。

1 材料與方法

1.1 標本來源收集

本院2014年 3月至 2015年 9月期間所有術前檢查病人共計35420例，年齡10～89歲，其中男性24003例，女性11417例。

1.2 試劑

HIV抗原抗體聯合檢測試劑盒（上海恒遠科技有限公司），化學發光酶免試劑 （北京科美東雅生物技術有限公司），人類免疫缺陷病毒（HIV1+2型+p24）抗體免疫印跡試劑盒（簡稱WB，新加坡 Genelabs）。

1.3 方法

1.3.1 Elisa法檢測HIV病毒 Elisa檢驗血清HIV抗體采用雙抗原夾心法。包被：將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/mL，在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1mL，4℃ 過夜。第二天，棄孔內溶液，緩沖液洗滌；加樣：加待檢樣品于上述反應孔中，置37℃孵育1h（同時做空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔）；加酶標抗體：在各反應孔酶標抗體37℃孵育1h，緩沖液洗滌；加底物液顯色：向各反應孔中加TMB底物溶液，37℃ 10min；終止反應：于各反應孔中加入硫酸。

1.3.2 CLIA法檢測HIV病毒 CLIA法檢驗模式為雙抗原夾心一步法免疫分析，借助于HIV（1+2）抗原制作出固相抗原，并將HIV（1+2）抗原采用辣根過氧化物酶進行標記，由此和待測樣品中的HIV抗體兩者就可以形成雙抗原夾心，洗滌之后，將化學發光底物液加入其中 ，測定其發光值。

1.3.3 免疫印跡檢測法（WB）檢測HIV病毒 HIV進行培養、濃縮、純化；HIV抗原在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按照分子量大小而分離；將分離的抗原轉移到硝酸纖維素膜上，將其切割成包含全部病毒蛋白的按照分子量大小排列的條膜；在反應槽中加待測樣品與條膜孵育，洗滌；加辣根酶標記的二抗；加顯色試劑。

1.4 判斷標準

化學發光法：S/CO≥1.00 為陽性，< 1.00 為陰性；Elisa法按照說明書。

1.5 確認實驗

將Elisa法或CLIA法篩選的陽性病例35例進行復檢，復檢仍為陽性病例用免疫印跡法進行確認。WB試驗陽性的判為HIV感染；若為陰性，判為未感染HIV；若WB試驗為可疑，4周后隨訪復查，復查為陽性判為HIV感染，否則判為未感HIV。

1.6 統計學處理

使用SPSS11.0軟件系統，計數資料進行χ2檢驗或Fishers確切概率法檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CLIA法與Elisa法檢測結果

35420例術前檢查病人中，用CLIA法篩檢出抗-HIV抗體陽性39例，陽性率為 0.110%；Elisa法篩檢出抗-HIV抗體陽性29例，陽性率為 0.082%。與Elisa法相比，CLIA法陽性率比較高，兩組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 WB確認實驗

從表1中可以看出，WB和CLIA均陽性為33例，CLIA真陽性率為0.093% ；WB和Elisa均陽性為25例，Elisa真陽性率為0.071%。比較CLIA和Elisa兩種方法，CLIA的真陽性率、假陽性率都升高。

2.3 CLIA 檢測不同S/CO值與W B 對比結果

從表2結果可見，CLIA檢測S/CO值>500 時，WB確認實驗 均為HIV陽性；CLIA 檢測結果S/CO值≤500時，WB確認實驗有可能為陰性；S/CO值越低，W B檢測結果為陰性的可能性越大。

3 討論

據報道[10]全球約有3億多人攜帶艾滋病毒，而我國在1985年發現首例艾滋病患者，到2014年二十年時間，患病人數已經達到10.4萬例，患者分布也從單一省份擴增到全國20多個省。性傳播、 經血傳播和母嬰垂直傳播[11-13]是人類感染HIV病毒的三條途徑，而血液傳播是主要途徑。因此早期篩查血液HIV病毒，對HIV患者的早診斷具有重要價值。

1998年Elisa第四代試劑問世，第四代Elisa試劑可以同時檢測p24抗原和HIV 1+2抗體，有效縮短了“窗口期”，因此得到廣泛應用。但是由于一項檢測同時與病毒、抗體結合，增加了相互干擾的機會，從而降低了第四代Elisa試劑的靈敏度和特異性[14-15]。而化學發光法[16-17]作為新型的免疫學檢測技術，因其靈敏度高較高。

從本實驗結果來看，化學發光法的真陽性率高于Elisa法，說明化學法試劑能在HIV病毒抗體效價較低時發揮作用，檢測患者HIV陽性，因此更有效避免臨床漏診現象。但是我們發現化學發光法的假陽性率也有所增加。通過對比S/CO不同區間，化學發光法的假陽性率發生在S/CO≤500并且隨著S/CO值降低，假陽性率升高明顯。因此在用化學發光法篩查血液HIV病毒，在S/CO值比較低時，應注意對此病例的復檢，同時加做WB，避免假陽性的情況出現。

綜上所述，化學發光試劑靈敏度高，操作簡單，非常適合血液HIV病毒的早期篩查。但是應注意假陽性率高的問題，通過進一步實驗進行確認，提高HIV篩查質量。

參 考 文 獻

[1] Zahra RT， Kayhan A ，Ehsan M，et al. Development of an integrase-based ELISA for specific diagnosis ofIndividuals infected with HIV[J]. Virological Methods ，2015，2（15）：61-66.

[2] Crowl R， Ganguly K， Gordon M， et al.HTLV-III env gene products synthesized in E.coli are recognized by antibodies present in the sera of AIDS patients. [J]Cell ，1985，41（3）：979-986.

[3] Gurtler L， MuhlbacherA， MichlU， et al.Reduction of the diagnostic window with a new combined p24 antigen and human immunodeficiency virus antibody screening assay[J].Virol. Methods，2003，75（1）：27-38.

[4] Brust S， Duttmann H， Feldner J，et al.Shortening of the diagnostic window with a new combined HIV p24 antigen and anti-HIV-1/2/O screening test[J].Virol Method，2000，90（2）：153-165.

[5] Ly TD， Plantier JC， Leballais L， et al. The variable sensitivity of HIV Ag/Ab combination assays in the detection of p24Ag according to genotype could compromise the diagnosis of early HIV infection. [J ]Clin Virol， 2012，55（2）：121-127.

[6] Tang S， Zhao J， Wang A， et al.Characterization of immune responses to capsid protein p24 of human immunodeficiency virus type1 and implications for detection[J].Clin Vaccine Immunol： CVI，2010，17（8）：1244-1251.

[7] DolcettiR，GiagulliC，HeW，etal.Role of HIV-1 matrix protein p17 variants in lymphoma pathogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（46）：14331-14336.

[8] Kafaie J，Dolatshahi M，Aiamian L，et al. Role of capsid sequence and immature nucleocapsid proteins p9 and p15 in Human Immunodeficiency Virus type 1 genomic RNA dimerization[J].Virology，2009，385（1）：233-244.

[9] 孫顯光，里天初，李志堅. 化學發光酶免疫試劑與 ELISA試劑檢測 H IV抗體的對比分析 [J] . 貴州醫藥 ，2009 ，2 （33）：161-162.

[10] Schur FK， Hagen WJ， Rumlova M， et al. Structure of the immature HIV-1 capsid in intact virus particles at 8.8 A resolution[J].Nature， 2015， 517（7535）：505-508.

[11] Sanchez-Conde M， Miralles P， Bellon JM， et al. Use of transient elastography for the noninvasive assessment of portal hypertension in HIV/HCV-coinfected patients[J].Viral Hep，2011，18（10）：685-691.

[12] Paredes R， Lalama CM， Ribaudo HJ， et al. Pre-existing minority drug-resistant HIV-1 variants， adherence， and risk of antiretroviral treatment failure. [J]Infectious diseases， 2010， 201（5）：662-671.

[13] Garcia-Diaz A， Guerrero-Ramos A， McCormick AL， et al. Evaluation of the Roche prototype 454 HIV-1 ultradeep sequencing drug resistance assay in a routine diagnostic laboratory[J].Clinical virology，2013，58（2）：468-473.

[14] 殷竹君，楊啟生，田玲玲，等.生物梅里埃第4代 HIV初篩試劑假陽性率增高問題的探討[J].中國國境衛生檢疫雜志 ，2007，30（2）：73 -74.

[15] Ki m S ，Lee JH， Choi J Y ，et at .False-Positive Rate of a “Fourth-Generation ”HIV Antigen/Antibody Combination Assay in an Area of Low HIV Prevalence[J].Clin Vaccine Immunol，2010 ，17（10）：1642 -1644 .

[16] 李璐，邢文革.化學發光技術在 HCV和HIV檢測中的應用 [J].中國艾滋病性病，2011，17（3）：382-385.

[17] 單東紅，許建波，錢萍芳等.探究窗口期弱陽性抗體血清在選擇抗-HIV 檢測試劑中的重要意義[J].中國性科學，2015，（6）：67-69.