大鼠腸道菌群對(duì)芍藥苷體外代謝轉(zhuǎn)化的研究

柯仲成+楊楠+侯雪峰+王愛東+封亮+賈曉斌

[摘要]為研究腸道菌群對(duì)芍藥苷在體內(nèi)吸收和代謝的影響，該課題在離體培養(yǎng)的大鼠腸道菌群中，加入芍藥苷進(jìn)行厭氧孵育，分析芍藥苷在48 h內(nèi)的變化過程，探討體外大鼠腸道菌群對(duì)芍藥苷的代謝轉(zhuǎn)化。采用UPLC監(jiān)測(cè)芍藥苷在不同孵育時(shí)間點(diǎn)的變化，色譜條件為：WelchromTM C₁₈色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm），流動(dòng)相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，流速0.4 mL·min^-1，柱溫30 ℃；同時(shí)運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS/MS對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定（ESI離子源，正離子模式檢測(cè)），結(jié)合化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量和MS裂解碎片信息，并輔以保留時(shí)間及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，分析芍藥苷腸道代謝規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)孵育24 h后，芍藥苷已經(jīng)完全被代謝轉(zhuǎn)化，得到的代謝產(chǎn)物包括芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯苷元、脫酰基-芍藥內(nèi)酯苷、脫酰基-芍藥內(nèi)酯苷元和芍藥內(nèi)酯B等。通過代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，離體的大鼠腸道菌群先將芍藥苷轉(zhuǎn)化成芍藥內(nèi)酯苷，然后通過脫葡萄糖、脫苯甲酰基和四元環(huán)裂解重排等多個(gè)途徑被進(jìn)一步代謝，將芍藥苷逐步轉(zhuǎn)化生成相對(duì)分子質(zhì)量更小、疏水性更強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，從而更好被腸道吸收。

[關(guān)鍵詞]芍藥苷； 腸道菌群； 生物轉(zhuǎn)化

[Abstract]In order to clarify the effect of intestinal flora on the absorption and metabolism of paeoniflorin in vivo， the metabolism of paeoniflorin by rat intestinal flora was studied under the in vitro anaerobic condition. Paeoniflorin was incubated with rat anaerobic intestinal flora for 48 h， and UPLC was used to detect the changes of paeoniflorin at different incubation time points under the following chromatographic conditions：WelchromTM C₁₈ chromatographic column （4.6 mm×100 mm， 5 μm）， with 0.1% formic acid（A）-acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min^-1， and column temperature was 30 ℃. UPLC-Q-TOF-MS with positive ion mode（ESI ion source） was applied to investigate the structural characterization of metabolic products. The structures of the metabolites were identified by accurate molecular weight， TOF-MS/MS fragmentation information， combined with retention time and literature data review， and the intestinal metabolic rules were then analyzed. After incubation for 24 h， the paeoniflorin was metabolized completely， and the resulting metabolites（albiflorin， albiflorinaglycone， deacylate albiflorin， deacylate albiflorin aglycone and paeonilactone-B） were detected in rat intestinal flora. The metabolic pathway analysis showed that the isolated rat intestinal flora first transformed peoniflorin into albiflorin， and then further metabolized by glucose removal， phenyl group removal， or four-membered ring pyrolysis and rearrangement. Paeoniflorin was gradually transformed into more hydrophobic metabolites with smaller molecular mass， which were better absorbed by the intestinal tract.

[Key words]paeoniflorin； intestinal bacteria； metabolism

doi：10.4268/cjcmm20162021

赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍P. veitchii Lynch.的干燥根，性苦，微寒，具有清熱涼血、散瘀止痛、清瀉肝火之功，可用于溫毒發(fā)斑，血熱吐衄，肝郁脅痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，目赤腫痛，癰腫瘡瘍^[1]。赤芍總苷是其主要活性部位，而芍藥苷則為代表性成分，研究表明其對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)均有顯著保護(hù)作用，還有抗腫瘤、保肝、抗炎、抗氧化等藥理活性^[2]。從結(jié)構(gòu)上來(lái)說，芍藥苷是一個(gè)糖苷類化合物，腸道吸收較差，口服生物利用度偏低，可能是通過葡萄糖苷酶代謝成苷元而發(fā)揮療效^[3-4]；而其結(jié)構(gòu)母核——蒎烷型單萜的四元環(huán)張力較大，容易斷裂，引起生物轉(zhuǎn)化。芍藥苷在腸道中發(fā)生降解或生物轉(zhuǎn)化的性質(zhì)，可能類似“前體藥物”。本試驗(yàn)采用離體代謝研究的方法^[5-6]，用富含大鼠腸道菌群的培養(yǎng)液與藥物在厭氧條件下共同孵育，考察腸道菌對(duì)芍藥苷的分解代謝作用，探討其在腸道中生物轉(zhuǎn)化的一般規(guī)律，為芍藥苷的腸道轉(zhuǎn)化吸收提供科學(xué)依據(jù)，為赤芍的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供參考。

1 材料

螺口厭氧試管（亨蓋特，16 mm×125 mm）；C-31-CX密封培養(yǎng)罐（日本三菱，2.5 L）；Pyramid 2200氣密隔離保護(hù)罩（法國(guó)Erlab）；Triple Q-TOF 5600質(zhì)譜儀（AB Sciex公司），配有電噴霧離子源ESI系統(tǒng)；LC-20AD型高效液相色譜（日本島津公司）；數(shù)據(jù)采集和處理分別采用 Analyst TF 1.6和Markerview1.2軟件。

芍藥苷（阿拉丁，純度>98.0%，批號(hào)1523046），乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher），甲酸（德國(guó)CNW），MGC厭氧培養(yǎng)產(chǎn)氣袋（日本三菱），水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 離體大鼠腸道菌對(duì)芍藥苷的代謝

2.1.1 TSB 培養(yǎng)液的配制 胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，用純化水配制而成，調(diào)節(jié) pH為7.2，經(jīng)121 ℃壓力下，蒸氣滅菌4 min后使用。

2.1.2 厭氧條件的建立 將所用的試劑、螺口厭氧試管、密封培養(yǎng)罐、厭氧產(chǎn)氣袋等置于氣密隔離保護(hù)罩，向保護(hù)罩內(nèi)充入氮?dú)猓瑓捬醪僮骶诟綦x罩內(nèi)進(jìn)行。

2.1.3 腸道菌液的制備 取6只大鼠的新鮮糞便溶于20%甘油和1.8%的氯化鈉混合溶液中（1∶5），加入玻璃珠渦旋 5 min，混勻后-80 ℃保存待用。試驗(yàn)前，取適量菌液，加入TSB培養(yǎng)液（1∶8）混勻，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，厭氧環(huán)境下溫孵12 h。

2.1.4 體外溫孵試驗(yàn) 取芍藥苷適量，分別用腸道菌液或雙蒸餾水為溶劑，配制得到芍藥苷質(zhì)量濃度為0.25 g·L^-1的腸道菌溫孵組和藥物對(duì)照組；并將不含芍藥苷的腸道菌液設(shè)為菌液空白組。分別在厭氧下將各組樣品置于37 ℃的恒溫震蕩搖床中（100 r·min^-1），分別孵育0，2，4，8，12，24，48 h。取溫孵的樣品500 μL，立即加入甲醇3 mL終止反應(yīng)，渦旋5 min，12 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?sup>[7]，進(jìn)樣前加入500 μL流動(dòng)相復(fù)溶，12 000 r·min^-1離心5 min，取10 μL上清用UPLC-MS/MS檢測(cè)。

2.2 HPLC-MS 色譜條件

色譜條件：WelchromTM C₁₈色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～5 min，2%～8% A；5～30 min，8%～20% A；30～45 min，20%～35% A；45～60 min，35%～60% A；60～65 min，60%～100% A，流速0.4 mL·min^-1，柱溫 30 ℃。色譜圖見圖1，藥物對(duì)照組并沒有新的色譜峰出現(xiàn)，而當(dāng)與腸道菌液孵育4 h后，芍藥苷（t_R17.18 min）濃度逐漸降低，并同時(shí)在t_R15.32，50.32 min左右出現(xiàn)明顯吸收峰；當(dāng)溫孵24 h后，只剩下50.32 min處吸收峰。

質(zhì)譜條件：正離子檢測(cè)；離子噴射電壓 5.0 kV；毛細(xì)管溫度 350 ℃；毛細(xì)管電壓3 kV；鞘氣（N₂）流速0.414 MPa；輔助氣流速0.035 MPa。總提取離子流圖見圖2，藥物對(duì)照組并沒有新的質(zhì)譜峰出現(xiàn)，而腸道菌孵育4 h后出現(xiàn)若干個(gè)峰，t_R15.32 min峰的m/z為481，t_R24.91，27.88 min峰的m/z215，t_R5.03 min峰的m/z319，當(dāng)溫孵24 h后，t_R17.18 min吸收峰消失。

2.3 代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定

代謝物a正離子模式的質(zhì)譜圖見圖3，在m/z代謝物c正離子模式的質(zhì)譜圖見圖5，在m/z377處發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰，為[M+H]⁺， 且在m/z359，341，215發(fā)現(xiàn)碎片離子峰，分別為 [M+H- H₂O]⁺，[M+H-2H₂O]⁺，[M+H-Glc]⁺，推測(cè)其為脫苯甲酰基芍藥內(nèi)酯苷。

代謝物d正離子模式的質(zhì)譜圖見圖6，發(fā)現(xiàn)在t_R24.91 min處有m/z215的準(zhǔn)分子離子峰，為[M+H]⁺，且在m/z197，185，179，167發(fā)現(xiàn)碎片離子峰，分別為[M-H₂O]⁺，[M-CH₂O]⁺，[M-2H₂O]⁺，[M-CH₂O-H₂O]⁺，推測(cè)d可能是脫苯甲酰基芍藥內(nèi)酯苷元。

代謝物e正離子模式的質(zhì)譜圖見圖7，在t_R27.88 min處有m/z215，197的準(zhǔn)分子離子峰，為[M+H+H₂O]⁺，[M+H]⁺， 且在m/z179，167，153發(fā)現(xiàn)碎片離子峰，分別為[M-H₂O]⁺，[M-CH₂O]⁺，[M+H-CO₂]⁺，結(jié)合文獻(xiàn)[9-10]及芍藥內(nèi)酯苷元的類型，推測(cè)e可能為芍藥內(nèi)酯B。

2.4 芍藥苷腸道菌群代謝途徑分析

對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)合化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量和MS裂解碎片信息進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)解析，分析腸道代謝規(guī)律。從芍藥苷自身的質(zhì)譜裂解規(guī)律，分析大鼠腸道代謝產(chǎn)物，得到芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯苷元、脫酰基芍藥內(nèi)酯苷、脫酰基芍藥內(nèi)酯苷元、芍藥內(nèi)酯B等。經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，結(jié)合化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量和MS裂解碎片信息^[11]，鑒定了芍藥內(nèi)酯苷、芍藥內(nèi)酯苷元、苯甲酰基芍藥內(nèi)酯苷、脫苯甲酰基芍藥內(nèi)酯苷元和芍藥內(nèi)酯B，代謝產(chǎn)物分析見表1，代謝途徑見圖8。

3 討論

本試驗(yàn)中，大鼠腸道菌對(duì)芍藥苷的代謝產(chǎn)物經(jīng)UPLC-MS檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)2 h時(shí)就有芍藥內(nèi)酯苷轉(zhuǎn)化生成，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，芍藥內(nèi)酯苷元、脫酰基芍藥內(nèi)酯苷、脫酰基芍藥內(nèi)酯苷元逐漸增加，24 h后檢測(cè)不到芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥內(nèi)酯苷元，48 h后則以脫苯甲酰基芍藥內(nèi)酯苷元和芍藥內(nèi)酯B為主，說明芍藥內(nèi)酯苷元被腸道菌群的代謝，轉(zhuǎn)化為極性較小的代謝產(chǎn)物， 有利于其在腸道內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)， 并能加快吸收入血而發(fā)揮藥效，水解是芍藥苷代謝的主要途徑，包括半縮醛酸、酯鍵和糖苷鍵水解；另外，蒎烷型雙環(huán)單萜四元環(huán)的開環(huán)裂解和遷移重排是腸道菌群代謝的另一途徑。

對(duì)于糖苷類成分而言，苷元是腸道菌群代謝的主要產(chǎn)物^[12]。但在前期實(shí)驗(yàn)中，大鼠口服芍藥苷或赤芍提取物后，在血漿中發(fā)現(xiàn)芍藥苷，但并未發(fā)現(xiàn)芍藥苷元或芍藥內(nèi)酯苷元。可能是由于酯鍵以及蒎烷型單萜的特殊四元環(huán)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致苷元在動(dòng)物體內(nèi)的快速生物轉(zhuǎn)化，受腸道菌群影響的同時(shí)，還可能被肝臟微粒體快速代謝^[13]，有待進(jìn)一步深入研究。

隨著萜類化合物生物活性的深入認(rèn)識(shí)，其血中移行成分及藥物代謝等方面的研究越來(lái)越受人們重視。劉鑫鑫等^[14]通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在大鼠腸內(nèi)菌群的作用下可以發(fā)生互相轉(zhuǎn)化，也通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，說明芍藥苷的代謝途徑有水解和氧化等，但并未深入分析和闡述腸道菌對(duì)芍藥苷的代謝途徑。另也有文獻(xiàn)報(bào)道，在體外腸道菌孵育，芍藥苷能被轉(zhuǎn)化為paeonimetabolin I^[15-16]，但本實(shí)驗(yàn)并未檢出，但推測(cè)有paeonimetabolin I的羥基化產(chǎn)物的存在，說明腸道菌群對(duì)藥物代謝易受諸多因素影響，如動(dòng)物種類及孵育方式等^[17-18]。綜上所述，芍藥苷易被腸道菌群代謝，掌握口服后其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律，可為深入理解蒎烷型單萜類成分的藥理作用機(jī)制提供幫助。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]