一測多評法測定新疆紫草中主要萘醌類成分的含量

趙文文+吳智敏+吳霞+趙海譽(yù)+陳筱清

[摘要]以β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧為內(nèi)參物，測定新疆紫草中乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、α-甲基-正丁酰紫草素的含量，建立紫草中5 種萘醌類成分的一測多評定量分析方法。采用高分辨LC-MS對含量測定的5個色譜峰進(jìn)行鑒定。采用不同高效液相（HPLC）系統(tǒng)和不同色譜柱考察相對校正因子的耐用性，同時采用外標(biāo)法與一測多評法對16 批新疆紫草藥材進(jìn)行分析，并對含量測定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明相對校正因子的耐用性良好，16 批樣品一測多評法與外標(biāo)法所得結(jié)果無顯著差異。所建立的含量測定方法可用于同時測定新疆紫草中5種萘醌類成分。

[關(guān)鍵詞]新疆紫草； 一測多評； 相對校正因子； 萘醌； LC-MS

[Abstract]This study is to determine five naphthaquinones （acetylshikonin， β-acetoxyisovalerylalkannin， isobutylshikonin， β，β′-dimethylacrylalkannin，α-methyl-n-butylshikonin） by quantitative analysis of multi-components with a single marker （QAMS）. β，β′-Dimethylacrylalkannin was selected as the internal reference substance， and the relative correlation factors （RCFs） of acetylshikonin， β-acetoxyisovalerylalkannin， isobutylshikonin and α-methyl-n-butylshikonin were calculated. Then the ruggedness of relative correction factors was tested on different instruments and columns. Meanwhile， 16 batches of Arnebia euchroma were analyzed by external standard method （ESM） and QAMS， respectively. The peaks were identifited by LC-MS. The ruggedness of relative correction factors was good. And the analytical results calculated by ESM and QAMS showed no difference. The quantitative method established was feasible and suitable for the quality evaluation of A. euchroma.

[Key words]Arnebia euchroma； quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）； relative correction factor （RCF）； naphthaquinone； LC-MS

doi：10.4268/cjcmm20162014

紫草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，性寒，具有涼血、活血、解毒和透疹的功能^[1]。紫草中主要有效成分為羥基萘醌類，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗過敏、保肝降酶等作用^[2]。《中國藥典》2015年版（一部）收載紫草來源于紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst. 或內(nèi)蒙紫草A. guttata Bunge 的干燥根，以β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧為含量測定指標(biāo)^[3]。近年來已有文獻(xiàn)報道紫草的多成分含量測定^[4-6]，但采用一測多評法進(jìn)行紫草的質(zhì)量評價未見報道。本試驗建立一測多評方法，以β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧為內(nèi)參物，同時測定乙酰紫草素，β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧，異丁酰紫草素，α-甲基-正丁酰紫草素的含量，為紫草的質(zhì)量評價提供參考。

1 材料

Agilent 1200 HPLC 系統(tǒng)（美國Agilent 科技有限公司），島津 LC-20A HPLC 系統(tǒng)（日本島津公司），Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)（美國沃特世科技有限公司），雙壓線性離子阱串聯(lián)高分辨質(zhì)譜Orbitrap Velos Pro （Thermo Fisher公司），戴安Ultimate 3000 超高效液相色譜儀，KQ-500VDE 型舒美雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），OHAUS DV215CD 1/10萬分析天平（美國奧豪斯儀器有限公司）。

甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher公司），甲酸為分析純（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司），氨水為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），純凈水（娃哈哈）。

乙酰紫草素對照品（上海士鋒生物科技有限公司，批號：B11181），β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B21977），異丁酰紫草素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B21519），β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111689-201504），α-甲基-正丁酰紫草素對照品（東京化成工業(yè)株式會社，批號：M1028）。

16批紫草藥材（1#，2#，3#，4#，5# 購自安徽亳州中藥材市場，6#，7#，8#，9#，10#，11#，12#，13#，14#，15#，16# 購自河北安國中藥材市場），產(chǎn)地均為新疆。經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院李佳教授鑒定為新疆紫草A. euchroma的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 一測多評法的建立

2.1.1 色譜條件 含量測定采用Hibar Purospher STAR LP RP-18e（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱，柱溫為25 ℃，檢測波長275 nm，流動相為乙腈-0.05%甲酸水（75∶25）等度洗脫，流速1.0 mL·min^-1，進(jìn)樣量10 μL，見圖1。

液質(zhì)聯(lián)用色譜分離采用Thermo Hypersil BDS C₁₈（2.1 mm×150 mm， 2.4 μm）色譜柱，柱溫為30 ℃，樣品盤溫度4 ℃，流動相為乙腈-0.2%氨水（75∶25）等度洗脫，混合對照品溶液進(jìn)樣1 μL，樣品溶液進(jìn)樣1 μL。

電噴霧電離源，負(fù)離子掃描模式，加熱器溫度為350 ℃，毛細(xì)管溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為35 V，噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣（N₂）流速為35 arb，輔助氣（N₂）流速為10 arb，樣品在FT模式下進(jìn)行全掃描（分辨率R為3萬，掃描范圍為m/z50～1 000）。數(shù)據(jù)采集和分析采用Xcalibur軟件。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取乙酰紫草素，β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧，異丁酰紫草素，β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧，α-甲基-正丁酰紫草素適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成1 L含上述5個成分分別為294， 599， 162， 198， 588 mg的混合對照品儲備液。再將對照品儲備液稀釋 2， 5， 10， 50， 100， 500倍得到共7個梯度濃度的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 LC-MS 成分確認(rèn) 采用LC-MS法按2.1.1項色譜及質(zhì)譜條件，對含量測定的5個色譜峰所對應(yīng)的成分進(jìn)行鑒定，通過與混合對照品溶液中5個成分準(zhǔn)分子離子峰對照，確認(rèn)供試品溶液中與混合對照品溶液中相同保留時間色譜峰，分別為乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和α-甲基-正丁酰紫草素，見表1。

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1.2項下7個混合對照品溶液進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（mg·L^-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到紫草中上述5個成分的線性方程見表2。

2.1.6 相對校正因子計算^[7] 以β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧為內(nèi)參物，按公式f_mn = f_m/f_n= （W_m/A_m）/（W_n/A_n），其中W_m/A_m，W_n/A_n分別表示內(nèi)參物和待測化合物單位濃度的響應(yīng)值。計算不同濃度（n=7）其余4個化合物的相對校正因子，結(jié)果f_DAL/AS，f_DAL/AAL，f_DAL/IBS和f_DAL/MBS平均值分別為0.99，1.40，0.85，1.23，RSD為0.50%，0.20%，2.2%，1.1%。

2.1.7 精密度試驗 精密量取同一濃度混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，5個萘醌類成分的峰面積RSD依次為0.36%，0.29%，0.80%，0.41%，0.27%。表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后的0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧，異丁酰紫草素，β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧，α-甲基-正丁酰紫草素的峰面積RSD值分別為1.8%，1.2%，2.2%，1.2%，1.4%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗 精密稱取同一樣品粉末，按2.1.3項下方法平行制備6份溶液，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各成分的含量，計算RSD分別為1.5%，1.7%，2.0%，1.5%，1.9%。表明方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次樣品 0.25 g共9份，分別加入一定量（高、中、低各3份）的對照品溶液，按2.1.3項下操作，計算加樣回收率，5個萘醌類成分加樣回收率平均值依次為97.40%，96.60%，99.90%，99.50%，96.30%，RSD依次為1.6%，2.9%，3.0%，1.4%，2.9%。表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 一測多評法的耐用性

2.2.1 相對較正因子的耐用性 試驗選用Agilent 1200，島津LC-20A和Waters e2695 3套高效液相色譜系統(tǒng)，Hibar Purospher STAR LP RP-18e（4.6 mm×250 mm， 5 μm），Kromasil C₁₈（4.6 mm×250 mm， 5 μm），Grace Vision HT C₁₈-HL（4.6 mm×250 mm， 5 μm），YMC-Pack ODS-AQ（4.6 mm×250 mm， 5 μm），Agilent Zorbax XDB-C₁₈（4.6 mm×250 mm， 5 μm）5種色譜柱，考察不同色譜系統(tǒng)對相對校正因子的影響，見表3。

2.2.2 待測組分色譜峰的定位 采用相對保留值作進(jìn)行色譜峰定位，考察不同色譜系統(tǒng)對相對保留 時間的影響，見表4。

2.2.3 一測多評法與外標(biāo)法結(jié)果比較 將收集的16批新疆紫草按2.1.3項下方法制備樣品溶液，按2.1.1項下條件進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法和QAMS法分別計算5種萘醌成分的含量，以5個成分之和計算總萘醌的含量，見表5，圖2。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取方法考察

根據(jù)紫草萘醌類成分的性質(zhì)，分別對提取溶媒（甲醇、丙酮、石油醚）、提取方法（超聲、回流、冷浸） 與提取時間（20，30，40 min）進(jìn)行了考察，確定甲醇超聲提取30 min，該方法簡便且藥材中的萘醌類成分提取較完全。將該方法與《中國藥典》2015年版（一部）紫草含量測定項下樣品溶液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所測得含量無明細(xì)差異，考慮到方法的的簡便性，仍采用甲醇超聲提取法。

3.2 內(nèi)參物的確定

從對照品來源有保證，廉價、易得方面考慮，選擇β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧為內(nèi)參物，體現(xiàn)一測多評法簡便、易操作、低成本的特點(diǎn)。

3.3 相對校正因子考察

本實驗考察了3套HPLC 系統(tǒng)、5種色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果表明色譜系統(tǒng)對相對保留因子影響較小，RSD均<3%，重復(fù)性良好。5個萘醌類成分具有相同的結(jié)構(gòu)母核，僅存在異己烯側(cè)鏈的取代基不同，但其中3個成分校正因子偏離1較多，主要因為異己烯側(cè)鏈作為紫外吸收助色團(tuán)，取代基不同，直接影響化合物的摩爾吸光系數(shù)，此外，側(cè)鏈取代基不同直接影響分子摩爾質(zhì)量，導(dǎo)致不同化合物單位質(zhì)量濃度（mg·L^-1）中摩爾濃度（mol·L^-1）不同，也是校正因子偏離1較多的主要原因之一。

3.4 色譜峰的定位

本試驗通過相對保留時間來評價色譜峰的定位效果，考察不同色譜系統(tǒng)對相對保留時間的影響，除Grace Vision HT色譜柱對乙酰紫草素相對保留時間影響較大外，其他色譜柱及HPLC系統(tǒng)對相對保留時間影響均較小，RSD均<5%，并且5個成分出峰順序均不受色譜系統(tǒng)的影響，見表4。

3.5 一測多評法與外標(biāo)法結(jié)果比較

本研究首次建立一測多評法測定新疆紫草中主要活性成分含量。各成分含量測定結(jié)果顯示一測多評法與外標(biāo)法無顯著性差異，提示建立的相對校正因子具有較好的可信度，QAMS計算結(jié)果可靠。

3.6 含量測定

目前，我國尚未見紫草栽培的報道，野生資源較為緊張。收集到的16批新疆紫草中，藥典含量測定指標(biāo)成分β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧僅在4#，14#，15#樣品中符合不少于0.30%的要求。該成分在總萘醌中所占比例較低，而在某些混偽品中，該成分含量較高^[8]，這也是市場上出現(xiàn)較多混偽品及摻雜現(xiàn)象的主要原因之一。因此，同時檢測多個萘醌類成分含量更有利于評價紫草藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。不同批次新疆紫草萘醌含量差異較大，以5個成分之和計算總萘醌的量在2.71～49.68 mg·g^-1，其中α-甲基-正丁酰紫草素含量與總萘醌含量呈正相關(guān)，見圖2，能夠一定程度反映藥材中總萘醌含量的高低，對紫草藥材質(zhì)量評價具有重要意義。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]