不同通氣條件對土壤中絲狀真菌類型的影響

夏　宇?

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南　長沙 410128）

不同通氣條件對土壤中絲狀真菌類型的影響

夏宇

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128）

以不同通氣條件處理的水稻田土壤為材料，通過稀釋涂布平板法篩選得到11株菌株；提取這些菌株的克隆保守序列（ITS序列）并對其進行擴增、測序、分析，并建立系統發育樹，鑒定這些菌株的種屬名稱。結果表明：這11株菌株分屬于真菌和放線菌兩大類，其中絲狀真菌又分為曲霉和枝孢霉兩類，其中青霉屬、曲霉屬親緣關系最接近。從通氣處理對土壤中絲狀真菌類型的影響結果可知，對水稻最有益的通氣方式為白天通氣兩次、在移栽前和分糵期通入0.3‰的H2O2。

絲狀真菌；稻田土壤；IST序列分析；系統進化樹

水稻是我國主要的糧食作物，而大部分時間水田土壤是被水覆蓋的，因此水稻田土壤中的微生物類型及其活動與旱地的有較大區別。而土壤通氣狀況對農田微生物區系、土壤微生物生物量以及植物-微生物共同體（內生菌根、根瘤及其與微生物）的活動等都有顯著影響，從而間接影響作物的產量[1]。

絲狀真菌（filamentous）俗稱霉菌（moulds），廣泛分布于土壤、水域、空氣及動植物體內外，在潮濕的氣候下大量生長繁殖，長出肉眼可見的絲狀、絨狀或蜘蛛網狀的菌絲體。霉菌對人類生活有較大危害。例如：許多霉菌會造成農作物和植物的病害；可引起農產品、紡織品、食品和其他工業產品的發霉變質，造成嚴重的經濟損失；還有的真菌能產生毒素，使人畜中毒，黃曲霉（Aspergillus flavus）產生的黃曲霉素（alfatoxin）就是典型的真菌毒素，具有較強的致癌作用[2]。

試驗模擬水稻田環境，通過預設管道對稻田土壤進行不同的通氣處理，研究在水稻栽培過程中不同通氣處理對土壤中絲狀真菌類型的影響，以期對作物栽培過程中改善生態環境起指導作用。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試材料及試劑供試稻田土壤從湖南省農業科學院附近的水稻田采集。供試水稻品種為深兩優876。試驗試劑有DNA提取試劑盒、裂解緩沖液（0.4 mol/L Tris-HCl，0.06 mol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，1%SDS，pH值8.0）、變性液（3 mol/L KAc，pH值4.6）氯仿、異丙醇、TE緩沖液、DNA標準分子量標記物、瓊脂糖、1×電泳緩沖液TBE、6×樣品緩沖液、溴化乙錠等。土壤中真菌采用土豆固體培養基培養。

1.1.2儀器設備培養皿、封口膜、試管、移液槍、錐形瓶、玻璃珠、恒溫培養箱、載玻片、顯微鏡、試管架、酒精燈、超凈工作臺、鑷子、接種環、PCR儀、冷凍離心機、研缽、吸水紙、水平板電泳槽、灌膠模具及梳齒、電泳儀、水浴鍋等。

1.2試驗方法

1.2.1通氣處理（1）水稻種子催芽。將超級水稻種子放入培養皿中，置于35℃恒溫培養箱中浸水培養5～6 d，期間每天早晚換水一次，直到水稻種子長出白色新芽。（2）移栽。將帶芽水稻種子移栽至稀泥中，長出水稻苗后轉移到玻璃大棚中進行栽培，并采用不同的方式對水稻土壤進行通氣，詳見表1。

表1　水稻培養中采用的不同通氣條件

1.2.2取樣取樣的時間為上午8:00～10:00，取距離土壤表面5 cm，靠近根部的土壤約10 g，并標記編號。

1.2.3典型代表菌種的挑選分離土壤中的微生物后選擇其中的絲狀真菌進行純化。經過一定時間培養后，培養基上長出菌落，根據菌落特征，初步判斷屬于何種類型的微生物，若菌體形態一致，則可認為是初步分離到純菌種。將分離培養所得的純絲狀真菌菌種，從平板培養基轉移到試管斜面培養基上，保存備用。觀察并記錄菌種的保存與生長狀況[3]。

1.2.4真菌總DNA的提取及ITS序列克隆測序（1）提取。參照何水林[4]的方法提取真菌總DNA。（2）ITS序列擴增。選用ITS通用引物[5]（ITS1：5'-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3'，由華大基因公司合成）進行PCR擴增。反應體系（25 μL）：引物（100 μmol/L）1 μL，模板1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應程序：95℃，3 min；94℃，1 min，54℃，45 s，72℃，45 s；35個循環；72℃，10 min。PCR產物于4℃保存。（3）PCR產物電泳。配制1%瓊脂糖凝膠，PCR產物上樣后在100 V恒壓下電泳20 min。電泳完成后，于凝膠成像系統中觀測是否獲得大小相當的目的片段[6]。（4）目的片段回收及測序。按何水林[4]的方法回收目的片段，送華大科技公司測序。

1.2.5生物信息學分析將測序結果與BLAST核酸數據庫進行比對分析，在所得分類報告的結果中取得分最高的序列（相似度均超過99%）作為種屬鑒定參照序列，供試真菌樣品的種屬分類按參照序列確定，以此構建出 11種絲狀真菌ITS序列的系統進化樹。

圖1　各菌種的表觀特征

2　結果與分析

2.1不同通氣處理對水稻土中真菌類型的影響

試驗結果顯示，除T2和T8處理以外，其他處理均分離得到1種或2種絲狀真菌。其中，T3、T5、T7、T9和CK處理分別得到1種真菌，編號分別為M11、M2、M6、M4和M8；而T1、T4、T6處理均分離得到兩種真菌，編號分別為M7和M9、M1和M3、M5和M10。各真菌表觀特征如圖1所示，經初步鑒定，M1～M11分別為煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、黃曲霉菌（Aspergillus flavus）、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、M4 草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）、枝孢菌菌（Cladosporium）、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）、芽枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）、桔青霉素菌（Penicillium citrinum）、尖孢枝孢霉菌 （Cladosporium oxysporum）、鏈霉菌（Streptomyces）和棘孢曲霉菌（ Aspergillus aculeatus）。

2.2各菌種ITS序列克隆結果

由于試驗克隆的是絲狀真菌的ITS序列，而真菌ITS區域長度一般在650～750 bp，因此采用1%濃度的凝膠分離得出了比較理想的效果。PCR擴增后，所有樣品的PCR產物經凝膠電泳顯示均能擴增出目的條帶，擴增產物大小在500～750 bp之間（圖2），可以看出目的條帶非常清晰，所有真菌通過PCR擴增出來的DNA樣品的目標帶都一致，且分子量大小相近，11個樣品都比較干凈，雜帶和降解現象都不明顯。因此可以初步斷定該方法可行，擴增產物可用于序列測定。

圖2　各菌種PCR產物的凝膠電泳（1～11分別為M1～M11的PCR產物）

2.3ITS序列序列生物信息學分析

根據BLAST核酸數據庫所得分類報告的結果，取每個報告中得分最高的序列（相似度均超過99%）作為種屬鑒定參照序列，供試真菌樣品的種屬分類按參照序列確定，分類結果如表2所示。

2.4各菌種的發育系統進化樹

表2　各菌株的序列比對結果及其種屬鑒定分析

構建出11種絲狀真菌ITS序列的系統進化樹（圖3），系統關系圖顯示分離出的絲狀真菌的親緣關系比較接近，只有M10與其他的絲狀真菌親緣關系較遠。根據遺傳距離可以將11個菌株分為 3個類群。

圖3　絲狀真菌菌株系統關系圖

其中，M1、M2、M3、M4、M6、M8、M11為同一類群——A群。種屬鑒定分析顯示：M1、M2、M3、M6、M11為曲霉屬，M4、M8為青霉屬，青霉屬和曲霉屬同屬于曲霉科的常見屬，區別僅僅是：曲霉屬的孢子梗是輻射狀排列，呈頭狀，分生孢子梗頂端膨大成為頂囊，一般呈球形，頂囊表面長滿一層或兩層輻射狀小梗（初生小梗與次生小梗），最上層小梗瓶狀，頂端著生成串的球形分生孢子；而青霉屬分生孢子成帚狀，從菌絲體伸向空中，各頂端的小梗產生鏈狀的青綠—褐色的分生孢子，分生孢子頂端無膨大。圖3中顯示同屬于煙曲霉的M1、M3、M6親緣關系最近，而屬于棘孢曲霉菌的M11親緣關系最遠。

M5、M7、M9為同一類群——B群，種屬鑒定分析顯示M5為枝孢霉菌，M7為芽枝狀枝孢菌，M9為尖孢枝孢霉菌，都為枝孢霉屬，親緣關系非常接近。枝孢菌能夠產生分生孢子，是暗色孢科的一種，室內和室外都比較常見，顏色為深綠色，因此經常與曲霉菌弄混。其實，枝孢菌與曲霉菌的區別主要在于枝孢菌的菌絲也帶有顏色，菌落整體呈現深色。

M10單獨為一類群——C群，通過種屬鑒定分析為鏈霉菌，鏈霉菌屬有發育良好的分枝菌絲，菌絲無橫隔，分化為營養菌絲、氣生菌絲、孢子絲。營養菌絲又名基內菌絲，色淺，較細，具有吸收營養和排泄代謝廢物的功能；氣生菌絲是顏色較深、直徑較粗的分枝菌絲；氣生菌絲成熟分化成孢子絲，孢子絲再形成分生孢子。鏈霉菌是最高等的放線菌，不屬于真菌，因此與其他10種菌的親緣關系非常遠。

由以上分析可將不同通氣條件下絲狀微生物分為兩大類：真菌和放線菌。其中絲狀真菌又包含曲霉和枝孢霉兩類。

3　討　論

rNDA-ITS序列分析可以初步斷定不同通氣條件下，土壤中絲狀真菌的大致分類地位，分析結果顯示各真菌的親緣關系比較接近，絕大多數都屬于叢梗孢目下的分支。這一結果表明叢梗孢目微生物可能是通氣土壤中真菌微環境構成要素。試驗分離得到的絲狀真菌對動物、植物都有不同程度的危害。

（1）煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）：該菌為致病菌，能引起人、畜和禽類的肺曲霉病及其他疾病，可侵染棉鈴和蘋果等，引起果實腐爛，或將孢子寄藏于種子上引發棉鈴曲霉病等[7-8]。

（2）黃曲霉菌（Aspergillus flavus）：該菌的主要危害在于其代謝產物——黃曲霉毒素。研究表明，除了致癌作用以外，黃曲霉毒素的毒性作用主要與抑制蛋白質合成有關，其分子結構中的雙呋喃環是產生毒性的主要原因；另外，黃曲霉毒素的細胞毒作用主要是干擾信息RNA和DNA的合成，進而干擾細胞蛋白質的合成，導致動物全身性損害[9]。因此，我國規定大米、食用油中黃曲霉毒素允許量標準為10 μg/kg，其他糧食，豆類及發酵食品為5 μg/kg，嬰兒代乳食品不得檢出。

（3）青霉菌（Penicillium）：該菌代謝產物青霉素是抗菌素的一種，含有青霉烷，能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。

（4）枝孢菌（Cladosporium）：枝孢菌不會產生任何對人體的直接毒素，但是枝孢菌孢子是一種廣泛的過敏原，會引發哮喘病人發作或有類似呼吸系統疾病患者的過敏反應；另外某些枝孢屬菌種可以引起人類感染，如枝狀枝孢可引起皮膚暗色絲孢霉病，多主枝孢可引起著色芽生菌病和皮膚暗色絲孢霉病等[10]。

綜上所述，在水稻種植過程中對土壤采取不同的通氣處理，可影響土壤中的微生物類型，進而對水稻的生長發育產生一定影響。其中，白天通氣產生的真菌比晚上通氣產生的真菌數量少；一日通氣兩次比一日通氣一次和兩日通氣一次產生的真菌少；灌漿期使用H2O2處理會使產生的絲狀真菌變多。其他時期，如移栽前和分蘗期用H2O2處理對水稻的影響不大。因此，對水稻栽培最有益的通氣方式為：白天采用排氣量50 L/min的空氣泵通過土壤中事先埋設的PVC塑料軟管向土壤根際輸氣4 min，輸氣時間采用定時器確定在每天8:00，17:00；同時，可在移栽前和分糵期采用同樣的空氣泵通過土壤中埋設的PVC塑料軟管向土壤根際輸入0.3‰的H2O2。

[1] 李 元，牛文全，張明智，等. 加氣灌溉對大棚甜瓜土壤酶活性與微生物數量的影響[J].農業機械學報，2015，（8）：121-129.

[2] 周德慶. 微生物學教程[M]. 北京：高等教育出版社，2011.

[3] 周德慶. 微生物學實驗教程[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[4] 何水林. 基因工程[M]. 北京：科學出版社，2008.

[5] 陳劍山. ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應用[J]. 安徽農業科學，2007，35（13）：3785-3786，3792.

[6] 王金婷. 生物化學實驗教程[M]. 武漢：華中科技大學出版社，2010.

[7] 劉 華，賀湘玲. 侵襲性曲霉菌感染現狀及實驗室研究進展[J]. 醫學臨床研究，2014，（11）：2262-2264.

[8] 史先英，韓宏分. 棉花鈴病的發生及其防治對策[J]. 中國棉花，2007，（2）：28.

[9] 趙玲玲 都啟晶 王世清，等. 黃曲霉毒素B_1的等離子體降解產物的急性毒性研究[J]. 食品科技，2016，（1）：325-330.

[10] 張中義，秦 蕓. 6種枝孢菌病害研究[J]. 西南農業大學學報，1997，（4）：315-319.

（責任編輯：成平）

Effects?of?Different?Ventilation?Conditions?on?Filamentous?Fungi?Type?in?Soil

XIA Yu
（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Took the paddy soil as material， treated with different ventilation conditions and 11 strains were screened by dilution coating plate method; cloning and sequence (ITS sequence) of these strains were amplified， sequenced and analyzed， and phylogenetic tree was established to identify the species of these strains. The results showed that the 11 strains were divided into fungi and actinomycetes， and filamentous fungi were divided into two groups: Aspergillus and Cladosporium， among them， the genetic relationship of the genus and Aspergillus was the closest. From the results of treatment effects of filamentous fungi type in the soil， the most beneficial ventilation method for rice was twice during the day， transplanting and tillering stage bubbled into 0.3 ‰ of H2O2.

filamentous fungi; paddy soil; IST sequence analysis; phylogenetic tree

S154.38

A

1006-060X（2016）10-0052-04

2016-06-29

夏 宇（1981-），男，湖南湘陰縣人，碩士研究生，研究方向：生物工程。