卷丹百合3種主要病毒脫毒方法研究

?周曉波，吳藝飛，丁茁荑，陳立培，李世樹，黃麗萍?

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南　長沙　410125；2. 湖南省蔬菜工程技術研究中心，湖南　長沙410125；3. 湖南省湘西自治州龍山縣經濟信息局，湖南　龍山　416000）

卷丹百合3種主要病毒脫毒方法研究

周曉波1,2，吳藝飛1,2，丁茁荑1,2，陳立培3，李世樹3，黃麗萍3

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南長沙410125；2. 湖南省蔬菜工程技術研究中心，湖南長沙410125；3. 湖南省湘西自治州龍山縣經濟信息局，湖南龍山416000）

為了獲得無病毒的優質種苗，以感染CMV、LSV和LRV的卷丹百合珠芽為試材，采用熱處理、莖尖培養結合添加病毒唑的方法，運用RT-PCR方法檢測病毒，探討最適宜的脫毒方法。結果表明：對于CMV，僅通過莖尖培養，剝取0.1～0.3 mm大小莖尖培養脫毒率可達100%，但成活率僅為45%；對于LSV，38℃高溫熱處理20 d后，剝取0.1～0.3 mm莖尖培養，脫毒效果最佳，可達90%以上；對于LRV，38℃高溫熱處理20 d后，剝取0.4～0.6 mm莖尖培養，添加10 mg/L病毒唑可使脫毒率達90%以上。綜合3種病毒的脫毒率和成活率，以38℃高溫熱處理20 d后，剝取0.4～0.6 mm莖尖培養，添加10 mg/L病毒唑，成活率較高，脫毒效果最好。

卷丹百合；病毒；脫毒方法

卷丹百合（Lilium lancifolium）屬百合科百合屬，為多年生宿根草本植物。球莖肥大，具有潤肺止咳、補中益氣、寧心安神的功效[1]，食用價值和藥用價值均非常高，受到廣大消費者的喜愛。卷丹百合在湖南、安徽和江西等省（區）都有分布，僅湖南龍山縣常年種植面積3 400 hm2，是該縣農業支柱產業之一[2]。卷丹百合生產上多采用無性繁殖，該技術造成病毒大量累積使植株發生病毒病。主要包括百合無癥病毒（lily symptomless virus，LSV）、百合叢簇病毒（lily rosettle virus，LRV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）等[3]，病毒的侵染造成產量下降、品質變劣，制約了百合的發展[4]。因此，當務之急是通過生物技術手段獲得百合脫毒苗，從源頭上掐斷病毒的侵染[5]。 1962年，Phillips最早進行百合脫毒研究，此后，很多專家相繼進行相關研究并取得了良好進展[7-11]。目前，僅2012年周曉波等[12]對LSV的脫毒條件進行探索性的報道，前人的研究側重于百合的組織培養或單一病毒的脫毒方法研究[13-17]，脫毒效果不很理想，在大規模應用上有一定的局限性，對卷丹百合多種病毒脫毒方法進行系統地研究暫未見報。研究分別以感染LSV、LRV和CMV的卷丹百合珠芽為試材，通過熱處理、莖尖培養結合添加病毒唑的方法，運用RTPCR方法檢測病毒，旨在探討最適宜的脫毒方法，為繁育優質的脫毒百合種苗提供參考，為百合產業的健康穩定發展提供保障。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為湖南省湘西龍山縣栽培多年的卷丹百合（均由湖南省湘西龍山縣農業局提供）。分別選擇具典型感染百合無癥病毒（LSV）、百合叢簇病毒（LRV）、黃瓜花葉病毒（CMV）的植株，采集百合珠芽備用。田間試驗在湖南省蔬菜研究所完成，室內試驗在湖南省工程技術研究中心完成。

1.2試驗方法

1.2.1不同脫毒方法對不同病毒的脫毒處理分別以感染CMV、LSV、LRV的卷丹百合珠芽為試材，在流水下清洗去表面的泥土，分別裝入200 mL玻璃杯中，上面蓋一層打濕的毛巾，放在38℃高溫條件下處理不同天數（0、10、20、30 d）后（其間注意保持濕度在80%～85%），洗凈表面粘液，用70%酒精處理30 s，再用升汞處理15 min，用無菌水漂洗5次后備用。將已經滅菌的百合珠芽在解剖鏡下，剝取不同大小（0.1～0.3、0.4～0.6、0.7～1.0 mm）的莖尖，接種在芽誘導培養基（MS+2.5 mg/L 6-BA+ 1.5 mg/L GA+ 0.5 mg/L NAA+0.1 g/L活性炭+0.6%瓊脂+3%白糖）中，添加不同濃度的病毒唑（0、5、10 mg/L）。每處理接種40個莖尖，培養40～50 d后統計植株成活率。培養條件：先在黑暗條件下培養10 d，后轉入光照強度600～800 lx，光照時間為10 h，溫度25℃。

表1　3種病毒的引物

1.2.2百合3種主要病毒檢測LSV和CMV 2種病毒采用王賢[18]和王麗花[19]所述的引物，LRV引物為通過NCBI Genebank中登記的病毒序列，利用引物設計軟件Prime 6.0設計而成，引物核酸序列見表1。

待百合莖尖長至較大時，轉至增殖培養基（MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 g/L活性炭+0.7%瓊脂+30 g白糖）中繼續培養30～40 d。待長出2～3片葉時切下葉片進行病毒檢測，稱取0.1 g百合組培苗葉片在液氮中研磨，用Trizol法提取總RNA，參照陳進[20]的RT-PCR法進行3種病毒檢測，統計不同脫毒方法的脫毒率。

1.2.3數據分析試驗數據采用SAS數據處理系統進行分析。

2　結果與分析

2.1熱處理時間及剝取莖尖大小對不同病毒的脫毒效果

分別將3種病毒百合珠芽在不同熱處理時間及不同莖尖大小的處理下接種在不添加病毒唑的芽誘導培養基中，培養40～50 d統計成活率后轉至增殖培養基中，培養30～40 d，待長出2～3片葉時進行病毒檢測并統計脫毒情況。由表2可知，對于CMV而言，莖尖的大小比熱處理的脫毒效果更佳，當剝取的莖尖在0.1～0.3 mm大小時脫毒率可達100%，隨著剝取莖尖的增大脫毒效果呈下降趨勢。由表3可知，對于LSV而言，熱處理脫毒效果優于莖尖大小，在一定范圍內，隨著熱處理時間的延長，脫毒效果呈上升趨勢，當熱處理20 d時，剝取莖尖大小<0.7 mm時，脫毒效果最佳，達90%以上，但如果再延長熱處理時間，脫毒效率反而下降。由表4可知，對于LRV而言，各處理脫毒效果均不佳，脫毒效果較好的處理為熱處理20～30 d結合剝取0.1～0.3 mm莖尖，脫毒率為70%以上，僅用熱處理結合剝取莖尖不能完全脫除該病毒。

綜合表2～4可以看出，各處理間差異顯著或極顯著。莖尖大小同植株成活率成正比，同病毒脫毒率成反比；熱處理時間在一定范圍內對植株成活率影響不大，但當處理超過30 d會大大降低成活率。不同的熱處理時間和剝取莖尖的大小對同一病毒的脫毒效果差異顯著，不同病毒在相同的處理條件下脫毒效果差異也顯著。

表2　熱處理時間及剝取莖尖大小對CMV的脫毒效果

表3　熱處理時間及剝取莖尖大小對LSV的脫毒效果

表4　熱處理時間及剝取莖尖大小對LRV的脫毒效果

表5　熱處理、莖尖大小及不同濃度病毒唑對不同病毒的脫除效果

2.2熱處理、莖尖大小及不同濃度病毒唑對不同病毒的脫毒效果

分別將3種病毒百合珠芽分別在38℃下處理20 d后，剝取不同大小接種在添加不同濃度的病毒唑（0、5、10 mg/L）芽誘導培養基中，培養40～50 d統計成活率后轉至增殖培養基中，培養30～40 d，待長出2～3片葉時進行病毒檢測并統計脫毒情況。結果見表5。

從表5可知，各處理間存在顯著或極顯著差異。添加病毒唑對植株成活率影響不大，但對脫毒率影響非常顯著，不同病毒種類對病毒唑的最佳濃度略有差異，在一定范圍內病毒唑濃度的高低與病毒脫毒率成正比。特別對于LRV而言，不添加病毒唑時，脫毒率只能達到70%左右，添加病毒唑后，各處理差異極顯著，試驗中最佳的脫毒方法為：38℃下熱處理20 d后，剝取0.4～0.6 mm莖尖，接種在添加10 mg/L病毒唑的芽誘導培養基中，脫毒率可達92.6%，提高脫毒率20%左右，效果非常明顯。

3　結論與討論

通過對CMV、LSV和LRV 3種病毒的脫毒方法的研究，篩選出適合各種病毒的最佳脫毒方法。3種病毒的脫除難易程度為：CMV

目前，百合的脫毒方法主要有熱處理、莖尖培養、輻射處理和化學藥劑處理等。由于莖尖頂端分生組織細胞分裂能力強，新陳代謝能力快，生長迅速，病毒含量極少或無[20]，因此莖尖培養是目前使用最廣泛的脫毒方法。剝取的莖尖越小，脫除病毒效果越好，但同時存在成活率低下，易褐化死亡等問題，因此僅以此一種方法難以達到預期的效果[21]。高溫熱處理能使病毒鈍化，抑制病毒的分化和轉移，使其失去活性[22]，但單一使用這種方法不能有效脫除病毒，結合莖尖培養可大大提高脫毒效率。添加病毒唑也可起到鈍化病毒、抑制病毒的自我復制和傳播，達到降解病毒的作用，但也存在單獨使用效果不明顯的問題，需結合其他方法方可達到理想效果[23]。

試驗采用莖尖培養結合熱處理及添加病毒唑的方法對感染CMV、LSV及LRV 3種病毒的卷丹百合進行研究，3種脫毒方法對不同病毒的脫毒效果差異顯著，3種方法相結合可以達到最好的脫毒效果，基本可以脫除3種病毒，這一結果與高慧卿[24]及王超[25]研究結果一致。試驗只針對CMV、LSV及LRV 3種病毒進行研究，其他病毒是否也適用這種脫毒方法還有待進一步研究。

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（責任編輯：夏亞男）

Detoxification?Methods?of?Three?Viruses?of?Lilium lancifolium

ZHOU Xiao-bo1，2，WU Yi-fei1，2，DING Zhuo-yi1，2，CHEN Li-pei3，LI Shi-shu3，HUANG Li-ping3
（1. Hunan Vegetable Research Institute, Changsha 410125, PRC; 2. Hunan Vegetable Research and Development Center, Changsha 410125, PRC; 3. Hunan Xiangxi Autonomous Prefecture Economic Information Bureau of Longshan, Longshan 416000, PRC）

In order to obtain high quality seedlings without virus， the tiger Lilium lancifolium three main virus detoxification methods were studied. Taking CMV infection， LSV and LRV tiger Lilium lancifolium bulbil as experimental materials， the heat treatment， stem tip cultivation method of adding ribavirin combination， in the process of test using RT-PCR method to detect virus， discussed the optimum method of detoxification. Research results showed that: for CMV， only through cultivation stem tip， wring 0.1-0.3 mm size stem tip seedling cultivation rate can reach 100%， but the survival rate is only 45%; For LSV， heat treatment(38 ℃) in 20 days， wring 0.1-0.3 mm meristem-tip culture， detoxification effect was the best， reached more than 90%; For LRV， heat treatment(38 ℃) in 20 days， wring 0.4-0.6 mm meristem-tip culture， add 10 mg/L ribavirin the detoxication rate reached above 90%. Comprehensive seedling rate and survival rate of the three kinds of virus， with heat treatment(38 ℃) after 20 days， wring 0.4-0.6 mm meristem-tip culture， add 10 mg/L ribavirin， high survival rate， detoxification effect was the best.

Lilium lancifolium; virus; detoxification methods

S644.1

A

1006-060X（2016）10-0007-04

2016-08-08

湘西科技開發專項（2014FJ4184）

周曉波（1979-），男，湖南岳陽市人，助理研究員，主要從事蔬菜育種與生物技術研究。

吳藝飛