HPLC法同時測定參芪扶正注射液中6種成分的含量

舒 娟，楊勝斌（1.銅仁市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州銅仁 554300；.銅仁市人民醫(yī)院，貴州銅仁 554300）

HPLC法同時測定參芪扶正注射液中6種成分的含量

舒 娟1＊，楊勝斌2（1.銅仁市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州銅仁 554300；2.銅仁市人民醫(yī)院，貴州銅仁 554300）

目的：建立同時測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Ultimate XB-C18，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，流動相為乙腈-0.5%甲酸（梯度洗脫），流速為1.2 ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、黨參炔苷和芒柄花素檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.62～5.67 μg（r=0.999 6）、0.78～6.31 μg（r=0.999 6）、0.36～3.48 μg（r=0.999 7）、0.81～6.72 μg（r=0.999 5）、0.82～7.03 μg（r=0.999 8）、0.58～6.62 μg（r= 0.999 7）；定量限分別為1.21、0.15、0.12、0.03、0.12、0.17 μg/ml；檢測限分別為0.35、0.35、0.04、0.01、0.03、0.04 μg/ml；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率分別為95.1%～101.1%（RSD=2.0%，n=9）、95.2%～100.7%（RSD=1.9%，n=9）、95.8%～100.2%（RSD=1.4%，n=9）、96.2%～100.6%（RSD=1.7%，n=9）、96.6%～101.2%（RSD=1.4%，n=9）、95.9%～99.5%（RSD=1.2%，n=9）。結(jié)論：該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、黨參炔苷和芒柄花素的含量。

參芪扶正注射液；高效液相色譜法；黃芪皂苷Ⅰ；黃芪皂苷Ⅱ；黃芪皂苷Ⅲ；黃芪皂苷Ⅳ；黨參炔苷；芒柄花素

參芪扶正注射液主要由黨參和黃芪兩味中藥材組成，具有益氣扶正的功效，主要用于提高氣虛患者的免疫力，改善其氣虛癥狀和生存質(zhì)量［1-3］。方中黃芪主要成分包括皂苷、氨基酸類、多糖以及黃酮等成分，其中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和芒柄花素是該藥材的主要活性成分，具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，在抗氧化、抗腫瘤和抗疲勞等方面亦具有較好的藥理作用［4-5］。黨參炔苷則是黨參的主要活性成分，其在提高免疫方面均具有較好的療效［6-7］。目前，尚未有對黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素這6種主要活性成分進(jìn)行同時測定的報道［7-10］。因此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）建立了同時測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素含量的方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1220型HPLC儀，自動進(jìn)樣器、柱溫箱、四元泵、LE-780型ELSD（美國Agilent公司）；EO243S型萬分之一電子天平（德國Eppendorf公司）；SQ-4200型超聲波清洗器（上海精密儀器儀表有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）。

1.2 藥品與試劑

參芪扶正注射液（麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，批號：2014050179、2014060132、2014070121、2014080131、2014090133，規(guī)格：250 ml/瓶）；黃芪皂苷Ⅰ對照品（批號：98087110）、黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?8086745）、黃芪皂苷Ⅲ對照品（批號：98082873）和黃芪皂苷Ⅳ對照品（批號：98086721）均購自美國Sigma公司，純度均≥98%；黨參炔苷對照品（批號：111712-201401）、芒柄花素（批號：111712-201412）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器：ELSD；流動相：乙腈-0.5%甲酸，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.2 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素對照品適量，精密稱定，置于同一25 ml量瓶中，加甲醇制成1 ml含黃芪皂苷Ⅰ1.12 mg、黃芪皂苷Ⅱ1.24 mg、黃芪皂苷Ⅲ0.78 mg、黃芪皂苷Ⅳ1.82 mg、黨參炔苷2.18 mg、芒柄花素1.23 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品20 ml，減壓蒸餾后得到浸膏并制備凍干粉末，備用。取上述凍干粉末0.1 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，放冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和配方比例分別制備缺黃芩和缺黨參的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備陰性對照溶液（A和B），即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液（A和B）各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以黃芪皂苷Ⅱ峰計(jì)為2 000，保留時間為25.5 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照A；D.陰性對照B；1.黨參炔苷；2.黃芪皂苷Ⅳ；3.黃芪皂苷Ⅲ；4.芒柄花素；5.黃芪皂苷Ⅱ；6.黃芪皂苷ⅠFig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control A；D. negative control B；1.lobetyolin；2.astragalosideⅣ；3.astragalosideⅢ；4. formononetin；5.astragalosideⅡ；6.astragalosideⅠ

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，分別置于5 ml量瓶中，加甲醇定容，超聲處理5 min，即得系列線性溶液；取上述溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），結(jié)果見表3。

表3 定量限與檢測限測定結(jié)果Tab 3 Determination results of quantitation limit and detection limit

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.2%、1.0%、1.3%、0.7%、0.8%、1.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.3%、1.2%、1.3%、0.9%、1.1%、1.6%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：2014050179）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量。結(jié)果，黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素的平均含量分別為0.082 0、0.007 9、0.017 1、0.049 0、0.003 9、0.052 8 mg/g，RSD分別為1.2%、1.1%、1.9%、1.7%、1.8%、1.8%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號：2014050179）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備凍干粉末，稱取9份，每份約2 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，分別加入低、中、高質(zhì)量的黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.10 樣品含量測定

取“1.2”項(xiàng)下5批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和黨參炔苷、芒柄花素的含量，結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 4 Results of recovery tests（n=9）

表5 樣品含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3 討論

筆者分別考察了甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸作為本試驗(yàn)的流動相對待測成分分離度的影響。結(jié)果，采用甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-水作為流動相時，各成分的分離度不好、均有拖尾現(xiàn)象，而采用乙腈-0.5%甲酸作為流動相時各成分分離效果均較好，因此選擇乙腈-0.5%甲酸為本試驗(yàn)的流動相。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時測定參芪扶正注射液中黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、黨參炔苷和芒柄花素的含量。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of Six Components in Shenqi Fuzheng Injection by HPLC

SHU Juan1，YANG Shengbin2（1.Tongren Institute for Food and Drug Control，Guizhou Tongren 554300；2.Tongren People’s Hospital，Guizhou Tongren 554300，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of astragalosidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，lobetyolin and formononetin in Shenqi fuzheng injection.METHODS：HPLC was performed.The detector was evaporative light scattering detector，column was Ultimate XB-C18with mobile phase of acetonitrile-0.5%formic acid（gradient elution）at a flow rate of 1.2 ml/min，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 0.62-5.67 μg for astragalosidesⅠ（r=0.999 6），0.78-6.31 μg for astragalosidesⅡ（r=0.999 6），0.36-3.48 μg for astragalosidesⅢ（r=0.999 7），0.81-6.72 μg for astragalosidesⅣ（r=0.999 5），0.82-7.03 μg for lobetyolin（r=0.999 8）and 0.58-6.62 μg（r=0.999 7）formononetin；limit of quantitation was 1.21，0.15，0.12，0.03，0.12，0.17 μg/ml；limit of detection was 0.35，0.35，0.04，0.01，0.03，0.04 μg/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 95.1%-101.1%（RSD=2.0%，n=9），95.2%-100.7%（RSD=1.9%，n=9），95.8%-100.2%（RSD=1.4%，n=9），96.2%-100.6%（RSD=1.7%，n=9），96.6%-101.2%（RSD=1.4%，n=9）and 95.9%-99.5%（RSD=1.2%，n=9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for the simultaneous determination of astragalosidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，lobetyolin and formononetin in Shenqi fuzheng injection.

Shenqi fuzheng injection；HPLC；AstragalosideⅠ；AstragalosideⅡ；AstragalosideⅢ；AstragalosideⅣ；Lobetyolin；Formononetin

R917

A

1001-0408（2016）30-4275-03

2016-05-18

2016-08-07）

＊主管中藥師。研究方向：中藥及中成藥的檢驗(yàn)方法及質(zhì)量控制。E-mail：563965969@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.32