HPLC法測定當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷的含量Δ

周 珺，王 登，張 黎，張 錦，2，李茂星，張汝學(xué)，2，賈正平#（.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，蘭州730000；3.西安大興醫(yī)院藥劑科，西安 7006）

HPLC法測定當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷的含量Δ

周 珺1＊，王 登2，3，張 黎1，張 錦1，2，李茂星1，張汝學(xué)1，2，賈正平1#（1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍高原環(huán)境損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局臨床中藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科，蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，蘭州730000；3.西安大興醫(yī)院藥劑科，西安 710016）

目的：建立測定當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷含量的方法，以期為控制該制劑的質(zhì)量提供參考。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Symmetry C18，流動(dòng)相為乙腈-水（含0.1%磷酸）（14∶86，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為230 nm，柱溫為20℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：芍藥苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10～80 μg/ml（r=0.999 3）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率為98.3%～104.9%（RSD=2.0%，n=9）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于測定當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷的含量。

當(dāng)歸芍藥散；芍藥苷；高效液相色譜法；含量測定

當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，由當(dāng)歸、白芍、川芎、澤瀉、茯苓和白術(shù)等6味中藥材組成［1］。方中重用芍藥斂養(yǎng)肝血、緩急止痛，當(dāng)歸助芍藥補(bǔ)養(yǎng)肝血，川芎行血中之氣滯，三藥共以調(diào)肝；澤瀉用量亦較重，意在滲利濕濁，白術(shù)、茯苓健脾除濕，三者合以治脾［2］。諸藥合用，肝血足而氣條達(dá)，脾運(yùn)健則濕邪除，肝脾調(diào)和而諸證自愈［3］。目前，當(dāng)歸芍藥散在臨床廣泛用于消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的治療［4］。芍藥苷為白芍中含量最高的有效成分之一，具有類似于當(dāng)歸芍藥散的抗神經(jīng)炎癥、抗氧化等作用，除此外還具有調(diào)節(jié)血脂、血壓等作用，可用于治療神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病并發(fā)癥等多種疾病［5-6］；且目前尚未有測定當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷含量的報(bào)道。因此，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定該制劑中芍藥苷含量的方法，以期為控制該制劑的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

JYT-5020型多功能動(dòng)態(tài)提取濃縮機(jī)組（上海矩源機(jī)械設(shè)備有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；BPZ-6033LC型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；600-966型HPLC儀，包括600型二元梯度泵、996型二極管陣列紫外檢測器、Millennium32色譜工作站（美國Waters公司）；BP210S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；LY10-300A型超聲波清洗機(jī)（上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司，功率：200 W，頻率：40 Hz）。

1.2 試劑

芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-200933，純度＞98.1%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為滅菌注射用水。

1.3 藥材

當(dāng)歸（批號(hào)：20140601）、白芍（批號(hào)：20140601）、澤瀉（批號(hào)：20140701）、川芎（批號(hào)：20140603）、白術(shù)（批號(hào)：20140101）、茯苓（批號(hào)：20130701）均購自亳州市遠(yuǎn)光中藥飲片廠，經(jīng)蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科主任藥師李茂星鑒定，分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根、毛茛科植物芍藥Paeonia laciflora Pall.的干燥根、澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep的干燥塊莖、傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖、菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wol的干燥菌核。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.1%磷酸）（14∶86，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：230 nm；柱溫：20℃，進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 樣品和溶液的制備

2.2.1 當(dāng)歸芍藥散 按《金匱要略》記載的各藥材配比（當(dāng)歸∶白芍∶澤瀉∶川芎∶白術(shù)∶茯苓=3∶16∶8∶8∶4∶4），精密稱取當(dāng)歸粉末14.0 g、白芍粉末74.7 g、茯苓粉末18.7 g、白術(shù)粉末18.7 g、澤瀉粉末37.3 g和川芎粉末37.3 g，混勻，置于2 L圓底燒瓶中。用相當(dāng)于藥材粉末總體積8倍量的蒸餾水浸泡1.5 h，加熱回流提取3次，每次1.5 h；靜置后紗布過濾，合并濾液，水浴濃縮，減壓干燥，粉碎得浸膏粉（其浸膏得率為27.97%，為干燥粉末）。共制備了3個(gè)編號(hào)（S1、S2、S3）的樣品。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的芍藥苷對照品2.5 mg，置于25 ml量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為100 μg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取“2.2.1”項(xiàng)下制備的干燥樣品粉末0.25 g，置于25 ml量瓶中，精密加入50%乙醇20 ml，超聲處理30 min，冷卻至室溫后，加50%乙醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝制備不含芍藥的陰性對照品，再按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)＞2 000，保留時(shí)間為9.71 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.芍藥苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative contol；1.peoniflorin

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、 0.5 ml，分別置于5 ml量瓶中，加50%乙醇定容，搖勻，即得系列線性溶液。取上述溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程為y=24 721x+238.98（r=0.999 3）。結(jié)果表明，芍藥苷的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10～80 μg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷峰面積的RSD= 1.16%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷峰面積的RSD=1.21%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下干燥樣品粉末適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷峰面積的RSD=1.18%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下干燥樣品粉末適量，共9份，每份約250 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，分別精密加入芍藥苷對照品810.0、1 015.0、1 215.0 μg，各3份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 1 Results of recovery test（n=9）

2.9 樣品含量測定

分別取3個(gè)編號(hào)的干燥樣品粉末各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算芍藥苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3，μg/mg）Tab 2 Results of contents determination of samples（n=3，μg/mg）

3 討論

《金匱要略》中記載當(dāng)歸芍藥散作為散劑以酒調(diào)服［2］，而現(xiàn)代臨床用藥及藥理研究中該方常以水煎劑入藥［7］。白芍為當(dāng)歸芍藥散方中主藥，芍藥苷為其主要活性物質(zhì)之一，芍藥苷屬蒎烷單萜苷類，熔點(diǎn)為196℃，易溶于水、甲醇、乙醇，在pH2～6條件下穩(wěn)定，在堿性條件下不穩(wěn)定［8］。2015年版《中國藥典》（一部）將乙醇作為芍藥苷含量測定的提取溶劑［9］。路小平［10］分別用甲醇、乙醇、重蒸餾水提取芍藥苷以探討最佳提取溶劑，提取率分別為3.01%、3.09%、3.07%，表明使用這3種提取溶劑結(jié)果無明顯差異。因此，本研究基于臨床用藥多以水煎劑入藥，同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、安全性等方面的因素，最終確定水為本試驗(yàn)的提取溶劑。

綜上所述，本方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于測定當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷的含量。

［1］ 張家禮.金匱要略［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2010：419.

［2］段富津，李飛，康廣盛.金匱要略方義［M］.哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1984：341.

［3］李佳曦.當(dāng)歸芍藥散組方配伍規(guī)律及其方證相關(guān)性研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

［4］Zhou K，Jia N，Jiang N，et al.Beneficial effect of Danggui-Shaoyao-San，a traditional Chinese medicine，on drowsiness induced by chronic restraint stress［J］.Neurosci Lett，2015，597：26.

［5］鄭世存，李曉宇，歐陽兵，等.芍藥苷藥理作用研究新進(jìn)展［J］.中國藥物警戒，2012，9（2）：100.

［6］王登，周珺，張錦，等.開心散和當(dāng)歸芍藥散對高脂飼料喂養(yǎng)的慢性應(yīng)激大鼠糖脂代謝的影響及HPA軸相關(guān)機(jī)制［J］.中藥材，2015，38（9）：1 919.

［7］賈家麗，卞俊.芍藥苷提取與分離純化的研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2014，25（31）：2 969.

［8］金利泰.天然藥物提取分離工藝學(xué)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，2011：266.

［9］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：462.

［10］路小平.芍藥苷提取溶劑的選擇［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（6）：1 016.

Content Determination of Peoniflorin in Danggui Shaoyao Powder by HPLC

ZHOU Jun1，WANG Deng2，3，ZHANG Li1，ZHANG Jin1，2，LI Maoxing1，ZHANG Ruxue1，2，JIA Zhengping1（1.Key Laboratory of the Prevention and Cure for the Plateau Environment Damage，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region/Key Disciplines of Clinical Chinese Materia Medica，State Administration of TCM，Lanzhou 730050，China；2.College of Pharmacy，GanSu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；3. Dept.of Pharmacy，Xi’an Daxing Hospital，Xi’an 710016，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of peoniflorin in Danggui shaoyao powder，and provide a reference for controlling the quality of the preparation.METHODS：HPLC was performed on the column of Symmetry C18with mobile phase of acetonitrile-water（containing 0.1%phosphoric acid）（14∶86，V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 230 nm，column temperature was 20℃，and injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range of peoniflorin was 10-80 μg/ml（r=0.999 3）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 98.3%-104.9%（RSD=2.0%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and specific，and can be used for the content determination of peoniflorin in Danggui shaoyao powder.

Danggui shaoyao powder；Peoniflorin；HPLC；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）30-4255-03

2015-11-02

2016-07-21）

（編輯：劉 柳）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81173620）

＊藥師，碩士。研究方向：天然藥物化學(xué)。電話：0931-8994676。E-mail：zhoujunh@163.com

#通信作者：主任藥師，博士。研究方向：天然藥物化學(xué)。E-mail：121189539@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.25