東北林蛙重組抗菌肽dybowskin-1ST部分理化特性和生物學活性研究

李 玉 劉 琦 王敬之 柴龍會 周 旋 肖向紅

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

東北林蛙重組抗菌肽dybowskin-1ST部分理化特性和生物學活性研究

李 玉 劉 琦 王敬之 柴龍會 周 旋 肖向紅*

(東北林業大學，哈爾濱，150040)

東北林蛙；

目的：對具有廣譜抑菌活性的東北林蛙(Ranadybowskii)重組抗菌肽dybowskin-1ST進行熱穩定性、酸堿穩定性、局部過敏反應(Arthus反應)及溶血活性分析，為進一步摸清重組肽的理化特性及其應用提供科學依據。方法：將重組抗菌肽dybowskin-1ST分別置于不同環境溫度(25～100℃)及不同酸堿環境(pH2～pH12)中處理4 h，觀察其對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)及大腸桿菌(Escherichiacoli)的抑菌環直徑，確定其穩定性；用不同濃度梯度的重組dybowskin-1ST進行溶血試驗和局部過敏反應(Arthus反應)。結果：1.重組dybowskin-1ST在25～100℃溫度及pH2～pH12環境下均有抑菌活性，其中，最適環境溫度為25℃；重組dybowskin-1ST在pH3～pH7范圍對Staphylococcusaureus抑菌活性較強(抑菌環直徑為12.77～13.17 mm)，在pH3～pH8范圍對Escherichiacoli抑菌性較強(抑菌環直徑為12.63～13.37 mm)。2.溶血試驗結果顯示，重組dybowskin-1ST對家兔紅細胞的溶血率在0.14%～4.4%；小鼠Arthus氏試驗觀察其腹部皮下重組dybowskin-1ST注射部位紅腫不明顯，無出血、壞死等炎性反應。結論：實驗結果顯示重組dybowskin-1ST具有較好穩定性、低溶血性及低致敏性，為其應用提供科學依據。

兩棲類動物皮膚腺分泌物中富含功能多樣、結構特殊的活性多肽。首先由Zasloff研究組在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的皮膚和胃粘膜上皮細胞發現抗菌肽(Maganins)[1]，隨后來自南美蛙的Dermaseptin、來自南亞虎紋蛙的Tigernin-1以及歐洲林蛙的Temporin A等多肽相繼被發現。抗菌肽作為兩棲類機體防御的主要活性物質，是兩棲動物機體固有免疫的重要組成部分之一[2-3]。兩棲類抗菌肽可以抑制細菌、原生生物及病毒的生長[4-8]，可用作新型的抑菌抗病毒藥。

本研究從東北林蛙(Ranadybowskii)皮膚分泌物篩選出一種新的抗菌肽dybowskin-1ST[9]，郭娜對其進行了體外重組表達并純化，得到分子量為6.7 KD的抗菌肽，且具有廣譜抑菌活性[10]。本試驗以東北林蛙皮膚重組抗菌肽dybowskin-1ST為研究對象，通過測定其熱穩定性、酸堿穩定性、局部過敏反應(Arthus反應)及溶血活性，為其進一步應用提供科學依據。

1 試驗材料

東北林蛙重組皮膚抗菌肽dybowskin-1ST凍干粉(本實驗室制備)、LB固體培養基、LB液體培養基、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922)菌懸液、PBS溶液、小鼠[合格證號SCXK-(吉)2011-004，體重為(20±2)]30只、兔血(百奧萊博)。

2 試驗方法

2.1 熱穩定性及活性的檢測

2.1.1 將重組dybowskin-1ST凍干粉稀釋成濃度為 100 μg/mL溶液，分別在25℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃環境(電熱恒溫水浴箱 上海醫療器械廠)中處理4 h，進行實驗。

2.1.2 分別將Staphylococcusaureus及Escherichiacoli懸液1 mL加入到含100 mL滅菌LB液體培養基的錐形瓶中，在氣浴搖床(IKA KS4000ic控制型搖床)37℃、150 rpm條件中培養14 h，各取1.5 mL菌液與50 mL滅菌LB固體培養基混勻。

2.1.3 制備雙層瓊脂平板，下層加入8 mL LB固體培養基，待其凝固后分別加入步驟2的產物，再次凝固后用200 μL無菌槍頭(直徑0.6 cm)打孔，每孔各加入步驟1中處理后的濃度為 100 μg/mL重組dybowskin-1ST 50 μL，空白對照加入100 μL PBS溶液，在恒溫培養箱(上海埃朗儀器有限公司)中37℃培養24 h觀察結果。

2.2 酸堿穩定性

將重組dybowskin-1ST凍干粉分別用pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12的PBS溶液稀釋成濃度為 100 μg/mL溶液，進行實驗。

按2.1中試驗步驟2及步驟3檢測各組抑菌活性。

2.3 局部過敏反應

隨機取成年小鼠30只，雌雄各半，隨機分為5組(對照組、試驗組1、試驗組2、試驗組3及PBS溶液組)，1～3試驗組小鼠腹部皮下反復注射0.2 mL濃度為100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL的重組dybowskin-1ST，重復4次，當局部出現細胞浸潤后，再次分別注射不同濃度的重組dybowskin-1ST。

分別觀察注射后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h及8 h的小鼠局部的紅腫情況。

2.4 溶血試驗

制備紅細胞懸液：取兔血于室溫下3 000 r/min離心(JOUAN公司MR1022型高速臺式冷凍離心機)10 min，收集底層紅細胞，PBS洗滌3次至上層溶液澄清，用PBS將紅細胞稀釋為2%的細胞懸液，備用。

在1～10號離心管中依次加入濃度為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.56 μg/mL、0.78 μg/mL、0.39 μg/mL、0.195 μg/mL重組dybowskin-1ST 100 μL，11～12號離心管分別加入100 μL水(陽性對照)和PBS溶液(空白對照)。1～11號管分別加入2%兔紅細胞懸液100 μL后充分混勻，37℃孵育1 h，于 1 200 r/min離心5 min。吸取上清液移至96孔板中，1～12號離心管分別對應96孔板中1～12孔，各設3個復孔。酶標儀(BioTek Synergy HT)測定540 nm下各孔光吸收值。溶血百分率依據以下公式計算：

2.5 數據分析

對所獲得的實驗數據利用SPSS軟件進行方差分析對數據進行分析比較，P<0.05認為差異顯著且有統計學意義。

3 結果

3.1 熱穩定性及活性檢測

重組dybowskin-1ST在25～100℃處理4 h后，肉眼觀察無固體沉淀或膠狀物，說明熱穩定性良好。25～100℃處理4 h后，重組dybowskin-1ST對Escherichiacoli及Staphylococcusaureus的抑菌試驗結果如圖1所示，抑菌環直徑及其統計學意義如圖2所示，顯示具有良好的抑菌活性。

如圖1、2所示，數據均有顯著性(P<0.05)，25～100℃處理后的重組dybowskin-1ST對Staphylococcusaureus均有抑制作用，其中25℃和70℃的抑菌活性較強，抑菌環直徑分別為14.37 mm及14.43 mm；25～70℃處理后的重組dybowskin-1ST對Escherichiacoli均有抑制作用，其中25℃的抑菌活性最強，抑菌環直徑為15.37 mm，但經80～100℃處理后其抑菌活性降低。

圖1 不同溫度下重組dybowskin-1ST的抑菌活性(A、B、C為Escherichia coli，D、E、F為Staphylococcus aureus)Fig.1 Antibacterial activity of recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST under different temperatures

圖2 不同溫度下重組dybowskin-1ST的抑菌環直徑(E為Escherichia coli，S為Staphylococcus aureus，組間對比變量有且只有溫度)Fig.2 Recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST zone diameters under different temperatures

3.2 酸堿穩定性試驗

將重組dybowskin-1ST凍干粉分別用pH2～pH12的PBS稀釋為100 μg/mL溶液，肉眼觀察無固體沉淀或膠狀物，說明酸堿穩定性良好。不同pH處理下重組dybowskin-1ST 對Escherichiacoli和Staphylococcusaureus均有抑制作用如圖3所示，抑菌環直徑及其統計學意義如圖4所示。

如圖3、4所示，數據均有顯著性(P<0.05)，重組dybowskin-1ST在pH2～pH8條件下對Staphylococcusaureus均有抑菌活性(抑菌環直徑為12.03～13.17 mm)，但在pH9～pH12下則抑菌活性不明顯(抑菌環直徑為11.0～11.7mm)；而重組dybowskin-1ST在pH2～pH12條件下對Escherichiacoli均有抑菌活性(抑菌環直徑為12.03～13.57mm)。

圖3 不同pH條件下重組dybowskin-1ST的抑菌活性(A、B、C為Escherichia coli，D、E、F為Staphylococcus aureus)Fig.3 Antibacterial activity of recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST under different pH

圖4 不同pH條件下重組dybowskin-1ST的抑菌環直徑(E為Escherichia coli，S為Staphylococcus aureus，組間對比變量有且只有pH)Fig.4 Recombinant antimicrobial peptides dybowskin-1ST zone diameters under different pH

3.3 局部過敏反應(Arthus反應)

1～3試驗組小鼠腹部皮下分別注射100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL重組dybowskin-1ST 0.2 mL，注射部位呈局限性條狀腫脹，長徑為2 cm。2 h后各試驗組無明顯炎性反應，腫脹長徑為1.5 cm；4 h后各試驗組腫脹長徑為0.9 cm；6 h后各試驗組腫脹完全消失；8 h后仍無紅腫熱脹。

3.4 溶血活性試驗

如圖5所示，數據均有顯著性(P<0.05)，不同濃度的重組dybowskin-1ST對家兔紅細胞的溶血率在0.14%～4.4%，其中，重組dybowskin-1ST為50 μg/mL時的溶血率最大，約為4.4%。

圖5 不同濃度重組dybowskin-1ST的家兔紅細胞溶血率Fig.5 Different concentrations of recombinant dybowskin-1ST rabbit red blood cell hemolysis rate

4 討論

兩棲類皮膚抗菌肽通常是由10～60個氨基酸構成的具有廣譜抗細菌、真菌、病毒和腫瘤的活性[11-14]的小分子肽。苗慧敏、楊淑靜發現在虹彩病毒脅迫下東北林蛙皮膚中抗菌肽Temperin-2ST、Ranatuerin-2Amb、Ranatuerin-2YJ、Temperin-YJa、Temperin-YJb等具有廣譜抗菌活性[15-16]；申屠德君[8]在東北林蛙皮膚中發現了一種具有抗菌活性的新型抗菌肽dybowskin-1ST[8]；郭娜對其進行了體外重組表達純化，獲得分子量為6.7 KD的重組dybowskin-1ST，且具有廣譜抑菌活性[10]。

影響蛋白質穩定性的主要原因包括：溫度、pH、氧化作用、蛋白水解酶、變性劑等。重組dybowskin-1ST作為肽類物質，其熱穩定性、酸堿穩定性和溶血活性等特性對于評估重組dybowskin-1ST是否具有潛在的應用前景具有重要意義。本試驗依據《消毒技術規范》(2008年)及CLSI標準[17]判斷抑菌活性(即抑菌環大于7 mm為有效)及敏感性，進行了不同溫度、pH條件下重組dybowskin-1ST的抑菌試驗。結果表明，重組dybowskin-1ST具有較好的熱穩定性和酸堿穩定性，在25～100℃條件下重組dybowskin-1ST對Staphylococcusaureus和Escherichiacoli均有抑制作用(P<0.05)，但80～100℃處理后對Escherichiacoli的抑菌活性降低。在pH2～pH12條件下重組dybowskin-1ST對Escherichiacoli和Staphylococcusaureus均有抑制作用(P<0.05)，其中重組dybowskin-1ST在pH 9～pH12條件下對Staphylococcusaureus的抑菌活性降低。究其原因，可能是抗菌肽由氨基酸組成且具有一定的蛋白質二級結構[18-19]，在高溫或強酸堿處理后使抗菌肽二級或三級結構被破壞(如二硫鍵、氫鍵、二級折疊等)，導致抗菌肽結構改變，抑菌活性降低。Arthus反應結果顯示，重組dybowskin-1ST具有低致敏性，無明顯炎性反應，且藥物吸收較快。根據《藥品標準》規定，供試藥品在1 h內出現溶血反應或溶血率大于5%的則不宜體內注射，本試驗中各濃度重組dybowskin-1ST溶血率(0.14%～4.4%且P<0.05)均低于5%。

本試驗結果表明，重組dybowskin-1ST具有較好的熱穩定性和酸堿穩定性，且溶血性和致敏性低，具有良好的應用前景。

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Ranadybowskii；Recombinant antibacterial peptide dybowskin-1ST；Thermal stability；Arthus reaction；Hemolytic activity

ThePhysicochemicalPropertiesandBiologicalActivityofRecombinantAntimicrobialPeptide-Dybowskin-1STinRanadybowskii

LiYuLiuQiWangJingzhiChaiLonghuiZhouXuanXiaoXianghong*

(NortheastForestryUniversity，Harbin，150040，China)

We analyzed the thermal stability，pH stability，local allergic reaction(Arthus reaction) and hemolytic activity of one antimicrobial peptide dybowskin-1ST in the frog Rana dybowskii which is characterized by broad-spectrum antibacterial activity． The physicochemical properties of its recombinant peptide were examined，thereby providing scientific basis for practical application． The recombinant antimicrobial peptide dybowskin-1ST was pretreated at different temperature( 25 - 100 ℃) and different pH environments( pH2-pH12) for 4 h． Then its stability was determined by observing the size of inhibition zone against Staphylococcus aureus and Escherichia coli． Hemolysis assay and Arthus reaction were performed with different concentrations of recombinant dybowskin -1ST． Result showed that recombinant dybowskin-1ST have antibacterial activity at ambient temperatures of 25-100℃ and pH2-pH12，wherein the optimum ambient temperature was 25℃． Recombinant dybowskin-1ST holds strong antibacterial activity against Staphylococcus aureus( inhibition zone diameter of 12. 77-13. 17 mm) at pH3-pH7. However，it holds strong antibacterial activity( inhibition zone diameter of 12. 63-13. 37 mm) against Escherichia coli at pH3- pH8. Hemolysis test showed that the hemolysis rate of the recombinant dybowskin-1ST on rabbit erythrocyte was 0. 14%-4. 4%． Arthus's test showed no bleeding，necrosis，inflammation at the abdominal injection site of mice with recombinant dybowskin-1ST． We conclude that recombinant dybowskin-1ST has good stability，low hemolytic and hypoallergenic properties，thereby providing scientific basis for practical application．

稿件運行過程

2016-01-15

修回日期：2016-02-01

發表日期：2016-05-10

抗菌肽dybowskin-1ST；

穩定性；

局部過敏反應；

溶血活性

S858.94

A

2310-1490(2016)02-129-05

東北林業大學大學生創新性實驗計劃項目(No.111025065)；國家級大學生創新訓練項目(No.111022519)；國家級實驗教學示范中心建設專項；國家自然科學基金項目(30870301)；黑龍江省自然科學基金重點項目(ZJN0604-02)

李玉，女，24歲，碩士研究生；主要從事分子生物學實驗研究。

*通訊作者：肖向紅，E-mail：xiaoxh2010@sina.com