HAV RT-PCR檢測方法的建立及其在豬群中的流行調查

艾志瓊，張　玲，2，李麗娟，李　澤，王云紅，申元英*

（1.大理大學公共衛生學院，云南大理671000；2.自貢市疾病預防控制中心，四川自貢643000；3.大理大學基礎醫學院，云南大理671000）

HAV RT-PCR檢測方法的建立及其在豬群中的流行調查

艾志瓊1，張玲1，2，李麗娟3，李澤1，王云紅1，申元英1*

（1.大理大學公共衛生學院，云南大理671000；2.自貢市疾病預防控制中心，四川自貢643000；3.大理大學基礎醫學院，云南大理671000）

目的：了解屠宰生豬中甲型肝炎的流行情況，探討豬作為HAV另一宿主和攜帶者的可能性，以期為人類甲肝的防治提供一定的理論依據。方法：采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法對大理地區屠宰生豬血清中HAV IgG檢測，逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）對屠宰生豬的全血和膽汁標本進行HAV RNA檢測，以甲型肝炎患者的血液和膽汁為陽性對照標本。結果：①屠宰豬血清樣本中檢測出HAV的抗體陽性率為73.3%（374/510）；②建立了甲型肝炎病毒的RT-PCR檢測方法；③用RT-PCR在陽性對照標本中檢出HAV RNA；④用RT-PCR在屠宰豬的全血和膽汁樣本中未檢出HAV RNA。結論：成功建立起RTPCR檢測待測樣本中的HAV RNA的方法；屠宰豬血清樣本中檢測出HAV的抗體陽性率較高；豬是否可以感染人的HAV還有待于進一步研究。

HAV；屠宰生豬；酶聯免疫吸附試驗；逆轉錄-聚合酶鏈反應；大理地區

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.022

甲型肝炎（Hepatitis A，HA）是由甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）引起的一種急性病毒性肝炎，是急性病毒性肝炎中感染率和發病率最高的一種〔1-2〕，是一種世界范圍流行的常見腸道傳染病。我國是甲型肝炎的高發地區之一，甲型肝炎已成為我國的一個重要公共衛生問題，越來越受到人們的重視〔3-4〕。1981年，詹美云等報道，HAV感染樹鼩后在其體內檢測出相關抗原抗體，近年來，屠宰豬血清中檢出抗-HAV亦有報道〔5-6〕。這些研究表明，HAV除了能感染黑猩猩、恒河猴等靈長類動物，HAV也可能感染非靈長類動物。本研究用醫用HAV診斷試劑盒檢測屠宰豬血清中HAV標志物，以了解HAV在屠宰豬中的血清流行狀況；用人HAV基因序列擴增屠宰豬HAV核苷酸序列以確定豬體內是否存在HAV的感染，由此探討豬作為HAV另一宿主和攜帶者的可能性，以期為人類甲肝的防治提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1樣本收集大理地區屠宰場屠宰生豬血清、全血各510份（每頭豬采血6 mL×2管，統一編號，其中1管用于分離血清，1管抗凝用于收集全血），收集膽囊176個，獲取膽汁176份；收集大理州各醫院甲肝患者的血液27份和膽汁32份，將擴增出目的條帶的標本作為陽性對照。

1.2主要實驗材料

1.2.1甲肝病毒來自凍干甲型肝炎減毒活疫苗。該疫苗是將甲型肝炎病毒H2減毒株接種于人倍體細胞KMB17株，經培養、收獲病毒液、提取病毒，加穩定凍干劑制成。由大理市疾病預防控制中心提供。

1.2.2引物選取保守的VP3-VP1區的核苷酸序列設計引物，序列如下，上游引物P1∶5’-CCTT-GAGATTTCGTGTTC-3’，下游引物P2∶5’-CCTATTGGCTTTCCCTTT-3’，由上海生工生物技術有限公司合成。擴增的目的片段長度為347 bp。

1.2.3試劑盒TRNzol-A+總RNA提取試劑，北京TIANGEN公司。RevertAidFirstStrandcDNAsynthsis Kit、RT-PCR試劑盒、PCR Master Mix試劑盒均購自Thermo公司。

1.3方法

1.3.1血清學檢測采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法對血清中HAV IgG檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2HAV疫苗復活備用將疫苗稀釋劑加入凍干粉劑后，可見澄明液體，1.0 mL中含甲型肝炎活病毒不低于6.5l g CCID50。

1.3.3核酸提取直接取病毒懸液（新鮮血液或膽汁上清）0.25 mL，加入0.75 mL TRNzol-A+，充分振蕩混勻，將樣品在室溫放置5 min；加入0.15 mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4℃條件下12 000 r/min離心10 min，樣品分為3層∶黃色有機相，中間層和上層無水相，RNA主要溶于水相中，把水相轉移到新管中，在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置30 min；4℃條件下12 000 r/min離心10 min，去上清，加入0.75 mL 75%乙醇對沉淀進行洗滌；4℃條件下12 000 r/min離心5 min，去上清。室溫放置晾干，加入100 μL RNase-free dd H2O，反復吹打、混勻，充分溶解RNA。隨即進行RT或-70℃保存備用。

1.3.4RT-PCR擴增條件的摸索RT反應的摸索∶使用MMLV和AMV反轉錄酶分別進行實驗；PCR擴增條件的摸索∶退火溫度42～55℃，引物濃度從10～30 μmol/L，循環參數25～35。

1.3.5PCR產物的檢測PCR產物用1.0%的瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，100 V 60 min電泳后用凝膠電泳成像分析系統觀察結果，以產物中出現347 bp條帶的樣品為陽性。

2　結果

2.1血清學檢測結果收集屠宰生豬血清510份，HAV-lgG陽性374份，陽性率73.3%。

2.2建立了甲型肝炎病毒的RT-PCR檢測方法反轉錄∶RT反應采用20 μL體系，其組成如下∶模板RNA 7 μL，引物P2（10 μmol/L）2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL，65℃5 min后立即冰上冷卻；后繼續添加5×Reaction Buffer 4 μL，Ribolock RNase抑制劑（20 U/μL）1 μL，dNTP mix（10 mm）2 μL，Revert Aid M-Mulv-RT（200 U/μL）1 μL。RT反應條件42℃60 min后70℃5 min。

PCR反應∶PCR反應體系采用50 μL體系，其組成如下∶10×PCR Buffer 5 μL、dNTP mix（10mM）1 μL、引物P1（10 μmol/L）1.5 μL、引物P2（10 μmol/L）1.5 μL、Taq酶0.25 μL、模板（cDNA）4 μL，ddH2O 36.5 μL。反應條件為∶95℃預變性，5 min；進入循環94℃30 s→47℃30 s→70℃，30 s，30個循環，72℃延伸7 min，最后4℃保存。用甲型肝炎減毒疫苗作為實驗樣本，經上述RT-PCR反應后電泳圖。見圖1。

圖1　甲型肝炎減毒疫苗RT-PCR電泳結果

2.3陽性對照RT-PCR結果運用建立的RT-PCR方法對收集的甲肝患者的27份血液和32份膽汁標本進行HAV RNA檢測，有2份血液標本和1份膽汁標本成功擴增出目的條帶，見圖2。將此兩份血液標本和1份膽汁標本作為陽性對照。

2.4豬血液和膽汁中HAV RNA檢測結果運用建立的甲型肝炎病毒的RT-PCR方法對屠宰生豬的血液和膽汁標本，經RT-PCR擴增后電泳結果未見任何條帶。見圖2。

圖2　屠宰生豬甲肝病毒PCR產物電泳圖

3　討論

在甲肝血清標志物中抗HAV-IgM是新近感染的標志，一般在發病后3～6個月轉陰，是早期診斷甲型肝炎最簡便和最可靠的血清學標志。抗HAVIgG屬于保護性抗體，是機體具有免疫力的標志，一般在體內可持續多年或終身，HAV-IgG抗體陽性，提示接種過甲肝疫苗或以往感染過甲肝病毒，具有流行病學意義，可為制定有效、合理的預防措施提供科學依據〔7-10〕。本次調查發現大理地區屠宰生豬的HAV-lgG陽性率為73.3%，提示大多數屠宰豬通過自然感染獲得了自身免疫，說明HAV在屠宰生豬中有較高的流行率。

PCR是具有高特異性和敏感性，是檢測病毒常用的一種方法〔11-12〕。本研究用甲肝減毒活疫苗作為研究樣本，成功建立起RT-PCR來檢測方法，已分別從樣人血液和膽汁標本中提取HAV RNA，并通過RT-PCR擴增出HAV目的基因片段，說明以血液和膽汁作為HAV RNA檢測的標本是可行可靠的。但本研究未能在屠宰生豬血液和膽汁標本中擴增出目的基因，可能原因有∶一是豬源HAV與人類HAV基因序列差異較大，用人類HAV的引物無法擴增出目的基因。諸多研究已表明人類HAV具有一定程度的核苷酸和氨基酸異質性〔13-15〕。這些研究表明甲肝病毒如同其它RNA病毒一樣，在生物體內存在密切相關的變異株分布。王昊〔16〕通過對不同甲型肝炎患者進行比較，發現不同患者各基因片段核苷酸變異率相差較大。可見，HAV在同物種不同個體間核苷酸變異較大，在不同物種間的基因序列差異較大也是可能的。另一種可能原因是甲型病毒性肝炎不是一種人畜共患病，豬不會感染人類甲型肝炎病毒。豬的血清中HAV-lgG陽性的出現可能是因為豬的細胞上有類似甲型肝炎病毒的抗原決定簇，導致HAV-lgG檢測出現假陽性〔16〕。

目前，對HAV在不同物種間的研究甚少。本研究HAV血清學檢測結果顯示豬源HAV-lgG陽性率雖較高，但缺少分子生物學相關證據，因此，對于豬是否可以感染人類甲型肝炎病毒還有待于進一步的研究，甲型病毒性肝炎是否像戊型病毒性肝炎一樣〔17〕，是一種人畜共患疾病，也有待于不同物種間HAV的深入研究。

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Establishment of Hepatitis A Virus RT-PCR Detection Method and Its Epidemiological Investigation in Swinery

Ai Zhiqiong1，Zhang Ling1，2，Li Lijuan3，Li Ze1，Wang Yunhong1，Shen Yuanying1*
（1.College of Public Health，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Disease Control and Prevention Centers of Zigong，Zigong，Sichuan 643000，China；3.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study the epidemic state of the Hepatitis A Virus（HAV）infection in swinery，and to explore the possibility of swine as another host or carrier of HAV for providing basis for prevention and controlling measures of human HA.Methods:Serum HAV-IgG of swine in Dali was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and HAV-RNA of swine blood and swine bile samples were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR），with the blood and bile of HAV as positive control.Results:①HAV antibody positive rate of the blood samples of swine were detected as 73.3%（374/510）；②RT-PCR method was built to detect HAV；③HAV-RNA of positive control samples were detected with RT-PCR；④HAV-RNA of swine blood and swine bile samples were not detected with RT-PCR.Conclusion:RT-PCR method is successfully built to detect HAV-RNA.The antibody positive rate of HAV is rather high in the blood sample of swine.Further research is necessary to demonstrate whether the swine could infect human HAV.

Hepatitis A virus（HAV）；swine；Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）；Reverse transcription-Polymerase chain reaction（RT-PCR）；Dali

R512.91

A

2096-2266（2016）10-0081-04

（責任編輯董杰）

云南省科技廳青年基金資助項目（2012FD035）；云南省科技廳應用基礎研究面上項目基金資助（2013FB060）

2016-03-09

2016-05-02

艾志瓊，講師，主要從事分子流行病學研究.

*通信作者：申元英，教授.