腦心通膠囊提取物通過增強CXCR4表達促進心臟干細胞遷移*

楊岳，李慧影，張璐莎，馬亞珂，趙步長，賈力夫，趙菁，陳璐，王虹

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津　300193；2.陜西步長集團，西安　710082）

腦心通膠囊提取物通過增強CXCR4表達促進心臟干細胞遷移*

楊岳1，李慧影1，張璐莎1，馬亞珂1，趙步長2，賈力夫2，趙菁2，陳璐1，王虹1

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津300193；2.陜西步長集團，西安710082）

［目的］探討腦心通（NXT）對小鼠心臟干細胞（CSCs）CXCR4表達的影響。［方法］應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）芯片技術研究腦心通對心臟干細胞功能基因表達的影響。采用流式細胞術檢測腦心通對心臟干細胞CXCR4表達的影響。應用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測腦心通對心臟干細胞CXCR4蛋白表達的影響。應用Transwell法測定腦心通對SDF-1誘導的心臟干細胞遷移能力的影響。［結果］芯片結果發現腦心通促進心臟干細胞CXCR4基因的表達；流式細胞技術結果顯示，腦心通促進心臟干細胞APC-CXCR4陽性細胞率；Western Blot結果表明，腦心通促進心臟干細胞CXCR4蛋白表達；Transwell遷移實驗結果顯示，腦心通促進SDF-1誘導的心臟干細胞的遷移作用。［結論］腦心通可以促進心臟干細胞CXCR4的表達。

腦心通；心臟干細胞；CXCR4的表達

缺血性心臟病及繼發的心功能衰竭已成為當今世界威脅人類健康的重大疾病之一，目前藥物治療、內科介入治療等僅僅只能恢復局部心肌組織的血液供應，不能從根本上修復已經發生壞死的心肌組織［1］。近年來細胞治療技術為缺血性心臟病的治療帶來了新的前景。

心臟干細胞（CSCs）又稱心臟祖細胞（CPCs），是一類存在于心臟組織中，具有自我更新、克隆形成、多種分化潛能，可分化為心肌細胞、內皮細胞及血管平滑肌細胞等多種細胞的干細胞。它的出現推翻了心臟是一個終末分化器官、缺乏自我更新潛能的這一傳統觀點。心臟干細胞可在心肌損傷后通過遷移來參與心臟損傷修復［2］，對心臟維持自我穩定及損傷修復具有重要意義。當前，基于心臟干細胞移植治療缺血性心臟病已成為心血管疾病研究中的熱點，研究已發現多種具有不同表型特征的心臟干細胞，它們均具有參與心肌和血管再生的能力，可用于缺血性心臟病的治療。

步長腦心通膠囊（以下簡稱腦心通，NXT）是根據中醫理論研制而成的中藥制劑，由黃芪、全蝎、地龍、水蛭、丹參、當歸、川芍、赤芍、紅花、乳香（制）、沒藥（制）、桑枝、桃仁、桂枝、牛膝16味中藥加工制成，具有活血化瘀、行氣止痛等心血管方面的藥物作用。藥理研究表明，腦心通膠囊中許多成分均對心血管有保護作用［3-4］。很多臨床實驗表明腦心通膠囊能有效改善心肌缺血癥狀，治療心血管疾病［5-8］。

本研究觀察了腦心通對小鼠心臟干細胞功能基因表達的影響，旨在探討腦心通能否干預心臟干細胞治療缺血性心臟病。

1　材料

1.1細胞及試劑心臟干細胞：由美國西北大學覃剛建教授惠贈；腦心通超微粉（步長公司）；DMEM/ F12，Hyclone；L-Glutamine、β-mercaptoethanol、36%多聚甲醛（Sigma公司）；MEM nonessential amino acids、Basic fibroblast grow factor（Gibco）；胎牛血清、胰蛋白酶液（Biological Industries）；High Pure RNA Isolation Ki（tRoche）；TaqManReverse Transcription Rengents、TaqManGene Expression Master Mix、基因芯片（Applied Biosystems）；Anti-CXCR4 antibody，abcam；APC Rat IgG2b，κIsotype Control、APC Rat anti-Mouse CD184（CXCR4，BD公司）；結晶紫染色液，碧云天；SDF-1、mTNF-α（RD公司）；24孔板小室、chemiluminescent HRP substrate，Millipore；全蛋白提取試劑盒，生工；PageRuler Prest Protein Ladder，Thermo；β-Actin（13E5）Rabbit mAb、BCA Protein Assay Kit（cell signal）；Anti-CXCR4 antibody，abcam。

1.2儀器ABI PRISM 7500（Applied Biosystems），EXPRESS PCR儀、SEMI-DAY TRANSFER CELL（BIO-RAD公司），流式細胞儀（BD公司），凝膠成像分析儀（Syngene公司），STIK氣套式二氧化碳培養箱［施都凱儀器設備（上海）有限公司］，Ti-U倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司），HR 40-ⅡA2生物安全柜（Haier公司）。

2　方法

2.1藥物溶液配制

2.1.1CCM完全培養液DMEM/F12，10%FBS，2 mmol/L L-Glutamine，0.1mmol/L β-mercaptoethanol，1%（V/V）MEM nonessential amino acids，5 ng/mL Basic fibroblast grow factor，1%（V/V）抗生素。

2.1.2腦心通混合物的提取腦心通超微粉172.36 g，以1∶8的料液比（kg/L）用1 378.88 mL 95%乙醇回流提取2 h，然后用布氏漏斗抽濾。所得濾渣用1 378.88 mL 60%乙醇按上述方法回流提取2 h，然后用布氏漏斗過濾。兩次濾液合并，以55℃水溫旋轉蒸發。旋蒸后置于蒸發皿中，在水浴鍋上揮去殘留有機溶劑，然后在真空干燥箱中烘干，最終得到腦心通超微粉提取物即腦心通混合物53.183 g。

2.2心臟干細胞的培養與傳代將心臟干細胞從液氮中迅速取出后，直接放入37～40℃的溫水中，快速搖動使其融化。在無菌條件下，吸出細胞凍存液，轉移至離心管并加入CCM完全培養基。1 000 r/min 25℃下離心5 min，去除上清液，再重復用培養液洗滌1次。加足夠量培養液輕輕吹打使其成為細胞懸液，移入培養瓶（接種密度為5×105/mL），置于5%二氧化碳（CO2）、95%空氣、37℃、飽和濕度的培養箱內培養，24 h后更換培養液繼續培養。

2.3腦心通對心臟干細胞關鍵功能基因表達的影響心臟干細胞種板培養24h后，分別向細胞中加入0.1%（V/V）二甲基亞砜（DMSO）和終濃度為12.5 mg/L的腦心通混合物。孵箱中孵育8 h后，采用High Pure RNA Isolation Kit提取總RNA，采用TaqMan Reverse Transcription Rengents試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA（20 μL體系），取反轉錄產物cDNA模板2.5 μL，按照TaqManGene Expression Master Mix試劑盒說明書進行實時定量PCR，測定心臟干細胞中基因相對表達量。采用2-ΔΔCt方法對實時定量PCR結果進行分析。功能基因的種類、符號及基因名見表1。

表1　功能基因的種類、符號及基因名

2.4腦心通對心臟干細胞流式CXCR4表達的影響心臟干細胞種板培養24 h后，分別向細胞中加入0.1%（V/V）DMSO和終濃度為6.25、12.5、25 mg/L的腦心通混合物。孵箱中培養48 h后，胰蛋白酶液進行消化，300 g下離心10 min收集細胞，Buffer洗去胰蛋白酶液。100 μL Buffer重懸細胞，加入10 μL APC Isotype Control或APC-CXCR4抗體，2～8℃下避光孵育45 min。加入適量Buffer洗去未結合的抗體，流式細胞儀檢測APC-CXCR4的表達。

2.5蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測腦心通對心臟干細胞CXCR4蛋白表達的影響心臟干細胞種板培養24 h后，分別向細胞中加入0.1%（V/V）DMSO和終濃度為12.5 mg/L的腦心通混合物。孵箱中培養48h后，用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCAProteinAssayKit對總蛋白進行定量。取20μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，Anti-CXCR4 antibody（1∶2 000）、β-Actin（13E5）Rabbit mAb（1∶1 000），4℃孵育過夜。加入按一定比例稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG（1∶15 000），室溫孵育1 h后顯影。采用凝膠成像分析儀進行電泳條帶的拍照與分析。將目的條帶與β-Actin灰度值的比值作為蛋白的相對表達水平。

2.6腦心通對SDF-1誘導的心臟干細胞遷移的影響心臟干細胞種板培養24 h后，分別向細胞中加入DMSO和終濃度為12.5 mg/L的NXT混合物。孵箱中培養24 h后，胰蛋白酶液進行消化，分別用含藥1%FBS CCM全培基懸浮細胞，將細胞密度調整至5×104/mL。將收集到的細胞分為4組（A～D組）：A組為陰性對照組下室內加入含0.1%（V/V）DMSO的1%FBS CCM全培基，B組下室內加入含SDF-1α（125 μg/L）的1%FBS CCM全培基，C、D組下室內加入SDF-1α（125 μg/L）+NXT混合物（12.5 mg/L）的1%FBS CCM全培基。在FN包被的小室的上室中，A～C組上室內均加入200 μL細胞懸液，D組上室內加入與100 mg/L CXCR4受體阻斷劑AMD3100共孵育30 min后的細胞懸液200 μL，將Transwell小室置孵箱中孵育。孵育4 h后，用棉簽擦掉濾膜上側沒有遷移的細胞，多聚甲醛固定20 min，D-Hanks洗2次，結晶紫染色10 min，用顯微鏡觀察染色的細胞，每個濾膜觀察6個隨機視野，進行拍照并計數染色陽性的細胞。

3　結果

3.1腦心通上調心臟干細胞CXCR4基因的表達以芯片技術研究腦心通對心臟干細胞功能基因表達的影響。研究發現，心臟干細胞在孵箱中經12.5 mg/L的腦心通混合物孵育8 h后，與空白對照組相比，腦心通能夠顯著上調心臟干細胞CXCR4基因表達（P＜0.05或P＜0.01），見圖1、圖2。

圖1　腦心通對心臟干細胞功能基因表達的影響

圖2　腦心通對心臟干細胞CXCR4基因表達的影響（±s，n=3）

3.2腦心通促進心臟干細胞CXCR4蛋白的表達以流式細胞術及蛋白免疫印跡法研究腦心通對心臟干細胞CXCR4蛋白表達的影響。研究發現，與空白對照組相比，腦心通促進心臟干細胞CXCR4蛋白的表達（P＜0.05或P＜0.01），見圖3、圖4。

3.3腦心通促進SDF-1誘導心臟干細胞的遷移作用Transwell遷移實驗研究發現，SDF-1能誘導心臟干細胞的遷移［（58.67±2.02）vs（83.80±9.19），P＜0.01，n=3］，腦心通能夠促進SDF-1誘導的心臟干細胞CXCR4的遷移［（83.80±9.19）vs（110.93±8.97），P＜0.01，n＝3］，加入AMD3100后，可顯著抑制腦心通對SDF-1誘導的心臟干細胞CXCR4遷移［（110.93± 8.97）vs（65.12±9.43），P＜0.01，n=3］。見圖5。

圖3　流式鑒定腦心通對心臟干細胞CXCR4表達的影響（±s，n=6）

圖4　NXT對CSCs細胞CXCR4蛋白表達的影響（±s，n=3）

4　討論

心臟干細胞的發現不僅改變了心臟屬于終末分化器官的傳統的認識，且為心臟疾病的治療提供了更為理想的種子細胞。現階段對心臟干細胞的來源爭議較大，Quaini等［9］認為心臟干細胞來源于骨髓。但是隨著研究的進一步深入，大量的實驗結果顯示心臟干細胞來自心臟，心臟干細胞巢是心臟干細胞來自心臟有力的證據［10］。由于心臟干細胞能特異性分化為心系細胞，其在心臟病細胞治療方面具有強大的優勢。心臟干細胞修復心臟主要通過心臟干細胞分化潛能及其旁分泌作用［11-12］，但其具體作用機制尚不明確，還需進一步的研究。

圖5　腦心通對SDF-1誘導的心臟干細胞CXCR4遷移的影響

趨化因子是指能使細胞發生趨化運動的小分子細胞因子。SDF-1屬于CXC類趨化因子，又稱為CXCL12或前B刺激因子，趨化活性高于其他趨化因子，最早由Nagasawa等［13］發現。CXCR4屬于CXCR類趨化因子受體，是趨化因子SDF-1的特異性受體。CXCR4與SDF-1共同作用控制細胞的遷移、組織的靶向作用及歸巢，但SDF-1/CXCR4軸調控CSCs遷移、歸巢的作用及機制有待進一步研究。Tang等［14］研究發現CSCs細胞缺氧預處理后，能上調CXCR4的表達，并且招募至缺血心肌，減少心肌梗死面積，改善心肌梗死后的心臟功能。

本實驗通過實時熒光定量PCR實驗發現腦心通上調心臟干細胞CXCR4基因的表達，用流式細胞術及Western Blot法證實了腦心通促進心臟干細胞CXCR4蛋白的表達，然后用Transwell遷移實驗證明腦心通能通過SDF-1/CXCR4軸促進心臟干細胞的遷移。SDF-1/CXCR4軸介導的信號轉導通路可分為G蛋白依賴的信號轉導通路和非G蛋白依賴的信號轉導通路兩個方面，研究發現非G蛋白依賴的信號轉導通路中p42/44MAPK信號通路和p38MAPK信號通路的活化與SDF-1誘導細胞的趨化、遷徙密切相關［15］，為后續實驗研究SDF-1/CXCR4軸調控CSCs細胞遷移的作用機制提供了思路。

近年來，研究發現CXCR7也可以與SDF-1相結合［16］，腦心通是否能通過SDF-1/CXCR7軸促進心臟干細胞的遷移有待進一步的研究。

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Naoxintong extract promotes migration of cardiac stem cells through enhancing expression of CXCR4

YANG Yue1，LI Hui-ying1，ZHANG Lu-sha1，MA Ya-ke1，ZHAO Bu-chang2，JIA Li-fu2，
ZHAO Jing2，CHEN Lu1，WANG Hong1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Shanxi Buchang Pharma，Xi'an 710082，China）

［Objective］To study the effect of Naoxintong（NXT）on cardiacstem cell function and to explore its possible mechanism.［Methods］We use real-time RT-PCR array technology，Western-blot，flow cytometry and transwell methods to investigate the expression of CXCR4 on the cardiac stem/progenitor cell by NXT.［Results］The results showed that the expression of CXCR4 gene and CXCR4 protein in cardiac stem cell were both increased by NXT.［Conclusion］The migration of cardiac stem cell is promoted by NXT through the SDF-1/CXCR4 axis.

NXT；cardiac stem cells；expression of CXCR4

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0099-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.08

國家自然科學基金項目（81173592）；新世紀優秀人才支持計劃項目（NCET-13-0935）；國家國際科技合作專項（2015DFA30430）；長江學者和創新團隊發展計劃（IRT1276）。

楊岳（1990-），男，碩士研究生，研究方向為中藥藥理、植物雌激素類中藥研究。

王虹，E-mail：wanghongsys@126.com。

（2015-11-21）