生甘草與炙甘草的抗氧化能力比較研究*

胡曉慧，代向東，李來來，閆海峰，王怡

（天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學，天津　300193）

·中藥研究·

生甘草與炙甘草的抗氧化能力比較研究*

胡曉慧，代向東，李來來，閆海峰，王怡

（天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津中醫(yī)藥大學，天津300193）

［目的］對生甘草與炙甘草的抗氧化能力進行比較。［方法］采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基法、鐵離子還原法、總抗氧化能力測試（ABTS法）以及福林試劑法測定藥物的抗氧化能力。［結果］生甘草與炙甘草均具有DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力和總抗氧化能力。［結論］生甘草與炙甘草均具有良好的體外抗氧化活性，實驗表明炙甘草的抗氧化能力大于生甘草并且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

生甘草；炙甘草；抗氧化活性

甘草為多年生草本植物，主要栽培在內蒙古地區(qū)，來源于豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrhizin）植物烏拉爾甘草（Glycyrrhizauralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖［1］。甘草的根和根莖主含三萜皂甙，其中60多種三萜類化合物，主要為甘草甜素，300多種黃酮素類化合物，多種香豆素類化合物，18種氨基酸，多種生物堿，多種有機酸和具網狀內皮活性的甘草多糖等多種具免疫興奮作用的多糖［2］。依據《全國中藥飲片炮制規(guī)范》記載，先取原藥材，除去雜質及蘆頭，大小條分開，浸泡至三四成熟，悶潤至透，切厚片，干燥。蜜甘草：取煉蜜用適量開水稀釋，加入甘草片拌勻，悶潤，至鍋內，用文火加熱，炒至表面棕黃色，不黏手為度，取出放涼。在《中華人民共和國藥典》（2010版）中記載，甘草按照干燥品計算，甘草苷不得少于0.5%，甘草酸不得少于2%。炙甘草中甘草苷不得少于0.5%，甘草酸不得少于1%。甘草炮制后其化學成分發(fā)生變化，藥物的功效進而改變，生甘草清熱解毒，炙甘草補脾益氣，生甘草多用于解毒、抗菌，炙甘草抗疲勞和抗氧化作用更明顯［3］。

自由基是指物質分子在光或熱等外界條件影響下，共價鍵發(fā)生均裂，形成的含有不成對電子，它可以是原子、分子或者基團，生物體內自由基的產生和清除及氧化損傷與心血管疾病密切相關［4］。目前針對甘草抗氧化活性的報道較少，本實驗通過1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH）清除自由基能力、鐵子還原能力，總抗氧化能力和福林試劑法的測定，比較生甘草與炙甘草的抗氧化活性能力，為臨床使用提供理論依據和物質基礎。

1　儀器與試藥

1.1儀器多功能酶標儀（Enpire，美國PerkinElmer公司），XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西儀器廠有限公司），微量移液器（Eppendorf），Costar-3599 96孔細胞培養(yǎng)板（美國Costar公司）等。

1.2試藥

1.2.1試劑抗壞血酸（天津市天新精細化工開發(fā)中心，分析純20140910），DPPH（Sigma公司，101508320），三氯化鐵（天津市贏達希貴化學試劑廠，分析純20140929），鐵氰化鉀（天津市贏達希貴化學試劑廠，分析純20130318），三氯乙酸（天津市福晨化學試劑廠，分析純20150320），總抗氧化能力測試試劑盒（Solarbio公司，S0119），福林酚試劑（Solarbio公司），無水碳酸鈉（天津市風船化學試劑科技有限公司），沒食子酸標準品（中國藥品制品檢定所，純度大于98%，20140909），磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，Solarbio，20131112），超純水（Milli-Q）其余試劑均為色譜純。

1.2.2藥材生甘草浸膏（中新藥業(yè)），炙甘草浸膏（中新藥業(yè)）。

實驗使用的生甘草浸膏和炙甘草浸膏均為水提物，藥廠提供生甘草與炙甘草浸膏，生甘草生藥的濃度與炙甘草生藥的濃度一致，生甘草出膏率為28.65%，炙甘草出膏率為30.03%，通過甘草浸膏和生藥材的折換率計算得知，生甘草浸膏濃度為243.525 g/L，炙甘草浸膏濃度為255.255 g/L，通過實驗性溶解最終確定生甘草和炙甘草浸膏的最大溶解度為250 g/L，由于浸膏折算生藥后的濃度差異無統(tǒng)計學意義，為比較生甘草與炙甘草的體外抗氧化活性，實驗選用生甘草浸膏和炙甘草浸膏的濃度為250 g/L。

2　方法

2.1配制生甘草浸膏與炙甘草浸膏溶液精密稱取生甘草和炙甘草浸膏750 mg，置于15 mg離心管中，加入超純水3 mL，配制濃度為250 g/L的生甘草和炙甘草溶液，先經超聲30 min，使用頻率100 Hz，之后使用離心機以3 500 r/min離心5 min，取上清液用于實驗。

2.2生甘草與炙甘草對DPPH自由基清除能力的測定將樣品溶液以每孔100 μL依次加到96孔板中，以每孔100 μL加入濃度為0.16 g/L的DPPH溶液；將100 μL甲醇與100 μL樣品溶液混勻，作為空白對照組；最后將100 μL甲醇與100 μL的DPPH溶液均勻混合，以每孔200 μL依次加入，作為陰性對照組；使用濃度為0.2 g/L的維生素C作為母液，稀釋8個梯度，按上文步驟測定。在37℃下充分反應50 min，在517 nm波長下測定A值，平行操作3次。清除率計算公式K=［1-（A1-A2）/A0］×100%，其中A1是測定樣品組對應的A值，A2是測定空白對照組對應的A值，A0是陰性對照組對應的A值［5］。

2.3生甘草與炙甘草對鐵離子還原能力的測定

2.3.1沒食子酸標準曲線的制備精密稱取沒食子酸（GAE）標準品，分別配制10個濃度的樣品溶液。分別取不同濃度的樣品0.2 mL，分別加入1 mL PBS（pH 7.2）和1 mL鐵氰化鉀（1%，w/v），混合均勻后在50℃水浴鍋中加熱20 min。后加入1 mL三氯乙酸（10%，w/v）均勻混合后，取上清液1 mL加入1 mL超純水，加入0.2 mL的氯化鐵溶液（0.1%，w/v），室溫靜置30 min，在700 nm波長下測定吸光度，以甲醇-水代替沒食子酸作為空白組，以沒食子酸的濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，根據Y= 0.0055X+0.0739（r2=0.998）繪制沒食子酸的標準曲線。

2.3.2沒食子酸當量的計算分別取生炙甘草溶液20 μL，加入980 μL甲醇配制成1 mL溶液，分別取0.2 mL，實驗步驟同沒食子酸標準曲線制備，樣品制備3份且3次平行實驗。在700 nm下測定其吸光度，利用回歸方程求出供試品溶液中折合沒食子酸的濃度，即沒食子酸當量。空白對照組：最后步驟不加0.2 mL的氯化鐵溶液，用200 μL超純水代替［6］。

2.4生甘草與炙甘草總抗氧化能力的測試

2.4.1ABTS工作液的配制用移液器精密取200μL的ABTS溶液和200 μL氧化劑溶液，配制ABTS工作母液。室溫避光存放12～16 h后使用，在3 d內穩(wěn)定。在使用前，把ABTS母液用PBS稀釋30倍即ABTS工作液。

2.4.2繪制標準曲線使用PBS稀釋標準品，把10 mmol/L Trolox溶液稀釋成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L。在96孔板的每個檢測孔中加入200 μL的ABTS工作液。空白對照孔加10 μL的PBS溶液；標準曲線檢測孔內加入10 μL的Trolox標準溶液；樣品檢測孔內加入10 μL各種樣品，輕輕混勻［7］。室溫孵育6 min后測定其A值，測定波長為734 nm。

2.5生甘草與炙甘草的抗氧化能力

2.5.1福利試劑實驗中沒食子酸標準曲線的制備分別取沒食子酸溶液，用甲醇稀釋到濃度為10個濃度，分別取100 μL沒食子酸溶液加入500 μL福林顯色試劑，均勻渦旋30 s，加入400 μL的碳酸鈉溶液，在30℃下反應90min，使用96孔板進行檢測，每孔加入200μL混合液體，每個濃度平行測試3組，波長765 nm，以待測液的溶劑為空白對照組［8］。

2.5.2藥物的含量測定精密取生甘草浸膏溶液和炙甘草浸膏溶液各100 μL加入500 μL福林試劑，均勻渦旋30 s，加入碳酸鈉溶液400 μL，30℃條件下反應90 min，用移液器取200 μL于96孔板中，藥物制備3份且平行實驗3次。按照標準曲線方法的波長測定其吸光度。

2.6統(tǒng)計學方法利用SPSS 17.0分析軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析，實驗結果以P＜0.05為顯著性差異，繪圖軟件使用Graphpad Prism Version5.0。

3　結果

3.1生甘草與炙甘草清除DPPH自由基能力的比較實驗采用體外清除DPPH自由基法［1］，通過SPSS 17.0分析軟件分析IC50作為指標，結果見表1。

3.2生甘草與炙甘草對鐵離子的還原能力測定通過實驗比較生甘草與炙甘草對鐵離子的還原能力，結果見表2。

表1　3種樣品對DPPH自由基清除能力的結果（±s）

表1　3種樣品對DPPH自由基清除能力的結果（±s）

注：與維生素C比較，**P＜0.01，與生甘草比較，##P＜0.01。

樣品nIC50生甘草浸膏溶液90.673 5±0.063 9**炙甘草浸膏溶液90.538 9±0.064 9**##維生素C溶液90.006 9±0.000 2

表2　生甘草和炙甘草的沒食子酸當量統(tǒng)計結果（±s）

表2　生甘草和炙甘草的沒食子酸當量統(tǒng)計結果（±s）

注：與生甘草比較，**P＜0.01。

樣品生甘草浸膏炙甘草浸膏n99沒食子酸當量（GAE）（mg/L）0.571±0.001 0.641±0.002**

3.3生甘草與炙甘草總抗氧化能力的測試實驗以Trolox的濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制Trolox溶液的標準曲線。Y =-0.685 8X+ 1.059 5（r2=0.999 1）。見圖1。

圖1　不同濃度標準品總抗氧化能力測試的標準曲線

通過ABTS方法比較生甘草與炙甘草對自由基的清除能力，經過SPSS17.0分析軟件分析，根據Trolox標準曲線，比較炙甘草與生甘草的體外抗氧化能力，炙甘草總抗氧化能力強于生甘草（P＜0.01），實驗結果見圖2。

3.4生甘草與炙甘草福林試劑法比較其抗氧化活性用沒食子酸標準品的濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制沒食子酸的標準曲線，回歸方程為Y=0.004 3X+0.098 6（r2=0.992 3），在1～500 mg/L圍內與吸光度呈良好的線性關系。沒食子酸溶液標準曲線結果見圖3。

實驗采用福林試劑法，對生甘草和炙甘草的總酚酸含量進行了測定，實驗結果見圖4，經SPSS 17.0分析軟件統(tǒng)計數據，雖然生甘草與炙甘草沒有顯著性差異但炙甘草的總酚酸含量高于生甘草的含量。

4　討論

研究表明外環(huán)境和內環(huán)境中某些化學物質進入機體后參與代謝過程，產生大量活性氧自由基、內源性抗氧化物質減少甚至耗竭，導致脂類、蛋白質等生物大分子的改變，進而引發(fā)疾病，抗氧化劑在體外實驗中均有清除自由基的作用［9］。抗氧化劑可抑制活性氧自由基產生或清除體內有害的自由基，減少腫瘤、炎癥和心血管疾病等退行性疾病。抗氧化能力的評價需要一定條件，如自由基近似于生物體體系，實驗的重復性強，進行常規(guī)質量控制等［10］。有學者提出自由基反應是人體衰老的內在機制之一，通過抑制自由基的過氧化反應，可提升人體的抗氧化能力，對中藥的抗氧化研究也將成為心血管領域的切入點［11］。甘草味甘，其主要化學成分為三萜皂苷類、黃酮類和多糖類化合物，作為補益的方藥多體現(xiàn)在對氣血陰陽的調節(jié)作用［12］。

圖2　總抗氧化能力測試結果

圖3　沒食子酸溶液的標準曲線

圖4　福林試劑法測試結果

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定的自由基，加入抗氧化劑時DPPH的單電子被配對，溶液顏色與配對電子數呈劑量相關性［13］，鐵離子還原法中藥物的還原能力與普魯士藍生成量成正比［14］，ABTS+·是一種穩(wěn)定的自由基，在抗氧化劑的作用下形成綠色的ABTS，最大吸收峰在734 nm，Trolox當量與藥物的抗氧化能力成反比［15］。福林試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈現(xiàn)藍色，在765 nm波長處有最大吸收峰，實驗以沒食子酸為標準品折算總酚酸含量比較其抗氧化能力［16］，本實驗中炙甘草的抗氧化能力大于生甘草。結合以上實驗說明炙甘草的抗氧化作用大于生甘草，甘草經過炮制其抗氧化作用有所增強，其他藥理作用可進一步研究。

在國際市場中甘草的市場份額和出口需求將逐年增長［17］，中藥的抗氧化作用的開發(fā)利用在醫(yī)療衛(wèi)生和護膚美容等方面均有應用，但其化學成分和物質基礎的研究還需進一步深入［18］。

［1］高學敏.中藥學（新世紀第2版）［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007：96.

［2］李薇，宋新波，張麗娟，等，甘草中化學成分研究進展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012，14（7）：40-44.

［3］孫付軍，周倩，王春芳，等，甘草炮制前后藥效學比較［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（14）：115-118.

［4］李向榮.抗氧化劑和自由基與血清白蛋白相互作用的微量熱和譜學研究［D］.新鄉(xiāng)：河南師范大學，2014：1-6.

［5］李晉，胡月，葛愛華，等.丹紅、丹參和紅花3種注射液抗氧化活性比較研究［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2015，34（1）：37-41.

［6］李艷霞，賈華麗，謝建平，等.鐵氰化鉀分光光度法測定藥物中維生素B1含量［J］.分析科學學報，2014，30（2）：294-296.

［7］張文彬，龔海英，張麗，等.天然產物抗氧化活性體內外評價方法［J］.武警后勤學院學報：醫(yī)學版，2013，22（11）：1035-1038.

［8］游見明，曹新志.福林酚法測定茶樹中茶多酚的分布水平［J］.湖北農業(yè)科學，2013，52（10）：2417-2419.

［9］Yen WJ，Chang LW，Lee CP，et al.Inhibition of lipid peroxidation and nonlipid oxidative damage by carnosine［J］. Jaocs，2002，79（4）：329-333.

［10］Rossum TGU，Vulto AG，Man RAD，et al.Review article：glyeyrhizin as a potential treatment forehroniehe Patitis C［J］. Aliment Pharmaeol Ther，1998，12（2）：199-200.

［11］袁蓉，郭麗麗，郜鳳香.痰瘀與自由基的關系探討［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2014，33（4）：242-245.

［12］Wang XT，Zhang H，Chen LL，et al.Liquorice，a unique guide drug of traditional Chinese medicine：A review of its role in drug interactions［J］.Journal of Ethnopharmacology，2013（150）：781-790.

［13］鄧薏.近5年國內中藥抗氧化作用研究進展（上）［J］.中藥藥理與臨床，2012，28（6）：155-162.

［14］曾維才，石碧.天然產物抗氧化活性的常見評價方法［J］.化工進展，2013，32（6）：1205-1213.

［15］丁亞芳，何靜，楊靜，等.總氧自由基清除能力法研究進展［J］.中藥材，2014，37（8）：1495-1499.

［16］李培源，霍麗妮，蘇煒，等.總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS）法測定江南星蕨的抗氧化活性［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（1）：162-164.

［17］卜彥花，周娜娜，王春悅，等.福林酚試劑法和紫外分光光度法測定冬棗多酚含量的比較研究［J］.中國農學通報，2012，28（1）：212-217.

［18］孫偉燕，韓明麗.中藥抗氧化作用的研究進展［J］.齊魯藥事，2010，29（3）：161-163.

Comparative study of antioxidant capacity between Shenggancao and Zhigancao

HU Xiao-hui，DAI Xiang-dong，LI Lai-lai，YAN Hai-feng，WANG Yi（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To compare antioxidant capacity between Shenggancao and Zhigancao.［Methods］Using the DPPH free radical，Iron ions reduction method，total antioxidant capacity test，Welfare reagent method to determine the antioxidant capacity of drugs.［Result］Shenggancao and Zhigancao all has DPPH radical scavenging capacity，ferric ion reducing power and the total antioxidant capacity.［Conclusion］Shenggancao and Zhigancao all has good antioxidant activity in vitro，experiments show that antioxidant capacity of Zhigancao better than Shenggancao，it has significant difference（P＜0.01）.

Shenggancao；Zhigancao；antioxidant activity

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0114-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.11

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2012CB518404）。作者簡介：胡曉慧（1989-），女，碩士研究生，研究方向為方劑學。

王怡，E-mail：13212268020@126.com

（2015-11-10）