五味子醇提物的提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化作用評(píng)價(jià)Δ

田　雙，嚴(yán)銘銘，邵　帥，劉　暢，尉忠賢，楊　洋（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長(zhǎng)春　130117）

五味子醇提物的提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化作用評(píng)價(jià)Δ

田雙＊，嚴(yán)銘銘#，邵帥，劉暢，尉忠賢，楊洋（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長(zhǎng)春130117）

目的：優(yōu)化五味子醇提物的提取工藝，并評(píng)價(jià)提取物及其純化物的抗氧化作用。方法：以總酚酸、總黃酮含量及對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基消除率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化五味子提取工藝中的提取次數(shù)、溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和溶劑倍量，并進(jìn)行驗(yàn)證；對(duì)最優(yōu)提取工藝所得提取物進(jìn)行純化，測(cè)定其對(duì)DPPH自由基的消除率和還原能力以評(píng)價(jià)純化物的體外抗氧化作用（以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照）。結(jié)果：五味子的最優(yōu)提取工藝條件為以8倍量70%乙醇加熱回流提取3次，每次1.0 h；驗(yàn)證試驗(yàn)中各指標(biāo)的RSD≤0.53%（n＝3）；提取物的30%乙醇洗脫部位抗氧化作用最強(qiáng)，其對(duì)DPPH自由基消除率和還原能力與維生素C相當(dāng)。結(jié)論：優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定、可行，所得提取物及純化物具有較好的體外抗氧化作用。

五味子；總酚酸；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)；抗氧化作用

五味子[Schisandra Chinensis（Turcz.）Baill.]為木蘭科植物，因皮肉甘酸，核中辛苦，且具咸味，故稱五味子。《中國(guó)藥典》中記載五味子具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效[1]。五味子中富含多種化學(xué)成分[2]，但目前的研究主要集中在木脂素和多糖類化合物[3-4]，而對(duì)總黃酮及總酚酸類化合物研究較少。大量研究表明，植物總黃酮及總酚酸類化合物具有很強(qiáng)的生物活性和藥理活性，如降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎等藥理作用，尤其具有明顯的抗氧化活性[5-6]。因此，本文對(duì)五味子中的抗氧化活性物進(jìn)行研究，旨在為五味子資源開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

UV-1700紫外分光光度計(jì)（上海澳瑞德精密儀器有限公司）；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化公司）；JD60-4萬(wàn)分之一電子分析天平[德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；CP225D電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2藥材、藥品與試劑

五味子的干燥成熟果實(shí)（采于吉林省白山市撫松縣種植地，于9－10月采摘，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定為真品）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：0721-200010，純度：92.5%）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-200302，純度：＞98%）均來(lái)源于吉林省藥品檢驗(yàn)所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、維生素C對(duì)照品（批號(hào)：20010217，純度：99.0%）均來(lái)源于美國(guó)Sigma公司；試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1五味子抗氧化活性物提取及純化制備工藝流程

五味子干燥果實(shí)→粉碎→脫脂（5倍量石油醚冷浸脫脂）→與溶劑混合→沸水浴加熱回流提取→過(guò)濾→濾液→減壓濃縮→干燥→得抗氧化活性物粗提物→聚酰胺法純化→得抗氧化活性物純化物。

2.2含量測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品25 mg、咖啡酸對(duì)照品1.5 mg，置于50 ml量瓶中，分別加甲醇和乙醇適量，超聲溶解，放冷，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備精密稱取五味子抗氧化活性物純化物0.01 g，置于50 ml量瓶中，加乙醇適量，超聲30 min溶解，取出，放冷，定容至刻度，濾過(guò)，即得。

2.2.3總黃酮含量測(cè)定[1]精密量取“2.2.1”項(xiàng)蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分別置于25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加入5%亞硝酸鈉溶液1 ml，振蕩搖勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液1 ml，振蕩搖勻，靜置6 min；加入氫氧化鈉溶液10 ml，加水定容至刻度，搖勻，放置15 min。以相應(yīng)的試劑為空白，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝9.54x+0.109 6（r＝0.995 0），表明蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.02～0.12 mg/ml。精密度試驗(yàn)的RSD為0.89%（n＝6），準(zhǔn)確度試驗(yàn)中平均回收率為97.28%（RSD＝1.41%，n＝6），表明本方法準(zhǔn)確、可靠。

2.2.4總酚酸含量測(cè)定[1]精密量取“2.2.1”項(xiàng)咖啡酸對(duì)照品溶液0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 ml，分別置于25 ml量瓶中，加無(wú)水乙醇至5.0 ml，加0.3%十二烷基硫酸鈉2.0 ml及0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀（1∶0.9）混合溶液1.0 ml，搖勻，于暗處放置5 min；加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻，暗處放置20 min。以相應(yīng)的試劑為空白，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝11.255x+0.063（r＝0.998 0），表明咖啡酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.3～4.8 μg/ml。精密度試驗(yàn)的RSD為1.39%（n＝6），準(zhǔn)確度試驗(yàn)中平均回收率為99.02%（RSD＝1.67%，n＝6），表明本方法準(zhǔn)確、可靠。

2.2.5樣品中總黃酮及總酚酸含量測(cè)定分別精密量取樣品液2 ml（測(cè)總黃酮）、1 ml（測(cè)總酚酸），各置于10 ml量瓶中，按“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)下操作顯色，測(cè)定吸光度，按各項(xiàng)下的回歸方程計(jì)算樣品液中總黃酮及總酚酸的含量。

2.3DPPH自由基消除試驗(yàn)[7]

取干燥潔凈的具塞試管，依次編號(hào)，量取樣品液2 ml置于具塞試管中，分別在各試管中加入2 ml 0.04 mg/ml DPPH溶液，渦旋混勻，于暗室反應(yīng)30 min。在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A1）。以2 ml甲醇代替DPPH溶液為陰性對(duì)照組，同法測(cè)定吸光度（A2）。以2 ml甲醇代替樣品液為空白對(duì)照組，同法測(cè)定吸光度（A0）。以蒸餾水作空白調(diào)零，平行測(cè)定3次，取平均值。計(jì)算DPPH自由基的消除率[（A0－A1+A2）/A0×100%]。

2.4提取工藝優(yōu)化

2.4.1單因素試驗(yàn) （1）提取溶劑考察。取6份五味子粉末各100 g，分別加入1 500 ml不同提取溶劑（水，10%、30%、50%、70%、90%乙醇），加熱回流提取3次，每次提取0.5 h。（2）提取次數(shù)考察。取4份五味子粉末各100 g，分別提取1、2、3、4次，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶15，提取時(shí)間為0.5 h。（3）提取時(shí)間考察。取5份五味子粉末各100 g，分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h，提取3次，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶15。（4）料液比考察。取5份五味子粉末各100 g，分別以料液比為1∶6、1∶8、1∶9、1∶10、1∶12加入70%乙醇，提取3次，每次提取2.0h。

取上述各提取液過(guò)濾，50條件下減壓濃縮干燥，分別取適量并用甲醇溶解、定容，得樣品液。按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行DPPH自由基消除試驗(yàn)（平行測(cè)定3次，取平均值），結(jié)果見圖1。

由圖1A可知，當(dāng)提取溶劑為70%乙醇時(shí)，DPPH自由基的消除率最大。由圖1B可知，隨著提取次數(shù)的增加，DPPH自由基的消除率逐漸增加；當(dāng)提取次數(shù)為3、4次時(shí)，DPPH自由基的消除率無(wú)顯著變化，因此提取3次即可。由圖1C可知，在提取時(shí)間為0.5～2.0 h時(shí)，DPPH自由基的消除率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.0、3.0 h時(shí)，DPPH自由基消除率無(wú)顯著變化，因此提取時(shí)間選2.0 h較適宜。由圖1D可知，隨著料液比的增大，DPPH自由基消除率增大；當(dāng)料液比為1∶10、1∶12時(shí)，DPPH自由基消除率無(wú)顯著變化，因此料液比以1∶10較適宜。

圖1　各因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig 1　Effects of each factor on the clearance rate of DPPH free radical

2.4.2正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇提取次數(shù)（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B，%）、提取時(shí)間（C，h）、溶劑倍量（D）為考察因素，以總酚酸含量（X1）、總黃酮含量（X2）及DPPH自由基消除率（X3）的綜合評(píng)分[以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，設(shè)定總酚酸含量、總黃酮含量、DPPH自由基消除率的權(quán)重系數(shù)分別為0.25、0.25、0.5，綜合評(píng)分（Y）＝0.25X1×100/ X1max+0.25X2×100/X2max+0.5X3×100/X3max]。取五味子藥材干燥粉末200 g，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)進(jìn)行加熱回流提取（平行測(cè)定3次，取平均值）。因素與水平見表1；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

由直觀分析可得各因素最優(yōu)組合為A3B3C3D3；由方差分析結(jié)果可知，以最小方差值D因素為誤差項(xiàng)，A、B因素結(jié)果具有顯著影響。經(jīng)綜合考察，為節(jié)省能源，提取時(shí)間選擇1.0 h，溶劑倍量選擇8倍量。最終確定最優(yōu)提取工藝為A3B3C1D1，即采用70%的乙醇提取3次，每次1.0h，加溶劑乙醇量為藥材量的8倍。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取3批五味子藥材，按最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果總酚酸含量分別為24.89%、24.77%、24.96%（RSD＝0.39%，n＝3）；總黃酮含量分別為11.41%、11.49%、11.53%（RSD＝0.53%，n＝3）；DPPH自由基消除率分別為92.47%、92.41%、92.58%（RSD＝0.09%，n＝3）。這表明優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行，且所制五味子醇提物具有較強(qiáng)的DPPH自由基消除作用。

2.6抗氧化作用試驗(yàn)

2.6.1純化物制備[8]取上述按最優(yōu)工藝提取的五味子提取物適量，加甲醇溶解，放至已裝好的聚酰胺柱中，分別用水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇以3倍柱體積（BV）的量進(jìn)行梯度洗脫，收集各梯度洗脫液，50條件下減壓回收溶劑，真空干燥得6種純化物樣品（編號(hào)為a～f）。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n＝3）Tab 2　Arrangement and results of the orthogonal tests（n＝3）

表3　方差分析結(jié)果Tab 3　Results of variance analysis

2.6.26種純化物的DPPH自由基消除率測(cè)定分別精密稱取上述6種純化物樣品各2 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度均為0.2 mg/ml的樣品液。將上述樣品液分別進(jìn)行DPPH自由基消除試驗(yàn)（平行測(cè)定3次，取平均值），篩選抗氧化活性作用最強(qiáng)的純化物。結(jié)果a～f的清除率分別為10.22%、27.69%、96.84%、68.22%、65.99%、66.54%，即當(dāng)洗脫液為30%乙醇時(shí)所得純化物（以下簡(jiǎn)稱為30%乙醇純化物）的DPPH自由基消除率最高，抗氧化活性最強(qiáng)。

2.6.330%乙醇純化物的DPPH自由基消除率試驗(yàn)取30%乙醇純化物樣品適量，加甲醇超聲溶解，制備成不同質(zhì)量濃度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/ml）的樣品液，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行DPPH自由基消除試驗(yàn)（平行測(cè)定3次，取平均值），結(jié)果見圖2。

圖2　2種樣品對(duì)DPPH自由基的消除作用比較Fig 2　The clearance of DPPH free radical by 2samples

由圖2可見，純化物的DPPH自由基的消除作用與其質(zhì)量濃度呈正比；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml時(shí)，對(duì)DPPH自由基的消除率最大，為95.57%，且與維生素C活性相當(dāng)（t檢驗(yàn)，P＞ 0.05）。

2.6.430%乙醇純化物的還原能力試驗(yàn)[9]取30%乙醇純化物樣品適量，加甲醇超聲溶解，分別制備成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml的樣品溶液。各量取2.5 ml至具塞試管中，分別加pH 6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）2.5 ml、1%鐵氰化鉀溶液2.5 ml，混勻，于50水浴中保溫20 min，取出后迅速冷卻；再加入10%三氯乙酸（TCA）2.5 ml，混勻，離心（3 000 r/min，離心半徑15 cm）5 min。取上清液2.5 ml置于試管中，加蒸餾水2.5 ml、0.1%FeCl3溶液0.5 ml，搖勻，靜止放置10 min。于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（a1）。以2.5 ml水代替樣品液為陰性對(duì)照，同法測(cè)定吸光度（a2）；以水為空白。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算還原能力a＝a1－a2，每管平行3次。a越大，則還原能力越強(qiáng)，結(jié)果見圖3。

圖3　30%%乙醇純化物的還原能力Fig 3　The reducibility of the purified extracts obtained with 30%%ethanol

由圖3可見，30%乙醇純化物的還原能力與其質(zhì)量濃度呈正比，且略高于維生素C，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t檢驗(yàn)，P＞0.05）。

3　討論

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化五味子醇提物的提取工藝，篩選出具有抗氧化活性的粗提物，再通過(guò)聚酰胺法進(jìn)一步對(duì)粗提物富集純化，并得出其30%乙醇洗脫部位為抗氧化活性最強(qiáng)的純化物，由此建立了一種具有較強(qiáng)抗氧化活性的五味子純化物的制備工藝。此方法操作簡(jiǎn)易，生產(chǎn)成本低，易于投入工業(yè)化生產(chǎn)。

近年來(lái)，對(duì)五味子藥材中的化合物相關(guān)研究越來(lái)越多，研制的相關(guān)藥品和食品也越來(lái)越多。由于五味子藥材來(lái)源廣泛，因此對(duì)五味子提取物進(jìn)行抗氧化活性的系統(tǒng)研究，具有重要的意義，可為五味子藥材的充分開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

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（編輯：劉萍）

Optimization of Extraction Technology of Ethanol Extracts from Schisandra chinensis and Their Antioxidation Evaluation in vitro

TIAN Shuang，YAN Mingming，SHAO Shuai，LIU Chang，YU Zhongxian，YANG Yang（Chinese Medicine and Biological Engineering Research and Development Center，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of ethanol extracts from Schisandra chinensis and evaluate the antioxidation of the extracts and purified extracts.METHODS：With the comprehensive score of the contents of total phenolic acids and total flavonoids as well as the clearance rate of 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）free radical as the evaluated index，single factor and orthogonal tests were designed to optimize the extraction times，the volume fraction of the solvent ethanol，extraction duration and solvent volume in the extraction technology of S.chinensis，and verification tests were conducted.After purification of the extracts obtained by the optimal extraction technology，the rates of clearance of DPPH free radical by the purified extracts and the reducibility of the purified extracts were determined to evaluate their antioxidation in vitro（vitamin C as positive control）.RESULTS：The optimal extraction technology of S.chinensis was as follows as heating reflux extraction with 70%ethanol 8 times as much as the extracts，3 extraction times and extraction duration of 1.0 h each time；the RSD of all indexes in the verification tests was lower than or equal to 0.53%（n＝3）.30%ethanol elution parts of the extracts had the strongest antioxidation，with a clearance rate of DPPH free radical and reducibility comparable to those of vitamin C.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology is stable and feasible；the extracts and purified extracts obtained by such technology have rather good antioxidation in vitro.

Schisandra chinensis；Total phenolic acids；Total flavonoids；Extraction technology；Orthogonal test；Antioxidation

R284.2；R285

A

1001-0408（2016）28-3976-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.27

吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（No.20140204070YY）

＊碩士研究生。研究方向：中藥化學(xué)。E-mail：1446316766@qq. com

教授，博士。研究方向：藥物化學(xué)、中藥化學(xué)及新藥開發(fā)。E-mail：yanmm595@yahoo.com.cn

（2016-01-07

2016-03-15）