茵黃合劑提取物對肝內膽汁淤積模型大鼠膽汁分泌和肝臟功能的改善作用Δ

席明名，王　俐，湯　倩，張啟春，顧　維#（.南京醫科大學附屬婦產醫院，南京　0004；.南京中醫藥大學藥學院，南京　009）

茵黃合劑提取物對肝內膽汁淤積模型大鼠膽汁分泌和肝臟功能的改善作用Δ

席明名1＊，王俐1，湯倩1，張啟春2，顧維1#（1.南京醫科大學附屬婦產醫院，南京210004；2.南京中醫藥大學藥學院，南京210029）

目的：考察茵黃合劑提取物（YHA）對肝內膽汁淤積模型大鼠膽汁分泌和肝臟功能的改善作用。方法：將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組（熊去氧膽酸，45 mg/kg）和YHA高、中、低劑量組[37.8、18.9、9.45 g（生藥）/kg]，每組10只。各給藥組大鼠ig相應藥物，空白組和模型組大鼠ig等容積生理鹽水，每天1次，連續5 d。給藥3 d后，除空白組外，其余各組大鼠均單次ig給予α-異硫氰酸萘酯誘導肝內膽汁淤積模型。末次給藥1 h后，檢測大鼠2 h膽汁流量和血清中總膽紅素（TBIL）、總膽汁酸（TBA）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）及堿性磷酸酶（ALP）水平；觀察大鼠肝臟病理變化。結果：與空白組比較，模型組大鼠2 h膽汁流量明顯減少，血清中TBIL、TBA、ALT、AST及ALP水平顯著升高（P＜0.01）；肝組織病理性損傷明顯。與模型組比較，除陽性組和YHA中、低劑量組大鼠血清中ALP水平以及YHA低劑量組大鼠血清中TBIL水平降低不顯著外，其余各組大鼠各指標均明顯改善（P＜0.05或P＜0.01）；除YHA低劑量組外，其余各給藥組大鼠病理損傷得到明顯改善。結論：YHA對α-異硫氰酸萘酯致肝內膽汁淤積模型大鼠的膽汁分泌和肝臟功能具有一定的改善作用。

茵黃合劑提取物；肝內膽汁淤積；肝臟功能；膽汁分泌；α-異硫氰酸萘酯；大鼠

茵黃合劑是南京醫科大學附屬婦產醫院的一種院內制劑，主要由杜仲、丹參、郁金、茵陳、山梔、黃芩、大黃、田基黃、云茯苓、白鮮皮等10味藥材組成，具有補腎安胎、通瘀利膽、健脾祛濕的作用[1]。該藥主要用于妊娠期肝內膽汁淤積的治療，已在臨床應用了20多年，其臨床應用綜合評分有效率高達90%，能顯著降低圍產兒死亡率，減少產后出血等并發癥，改善妊娠結局。據文獻報道，茵黃合劑對正常和雌激素誘導膽汁淤積癥模型大鼠膽汁分泌均有明顯的促進作用，同時還具有改善膽汁淤積癥模型大鼠肝臟功能以及調節大鼠膽汁酸轉運體的作用[2-3]。為進一步驗證茵黃合劑對膽汁淤積癥的改善作用，筆者利用大孔樹脂對茵黃合劑進行了提取純化，獲得茵黃合劑提取物（簡稱YHA）；并采用α-異硫氰酸萘酯復制急性肝內膽汁淤積大鼠模型進行YHA的藥效評價，為更好地應用和開發此藥提供參考。

1　材料

1.1儀器

7100全自動生化分析儀（日本日立高新技術公司）；R2002B旋轉蒸發儀（安中諾爾儀器有限公司）；BX51熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

1.2藥品與試劑

YHA（南京市婦幼保健院藥劑科自制，批號：20140912，規格：每1 ml含生藥1.8 g）；α-異硫氰酸萘酯（美國Sigma-Aldrich公司，批號：13054EC）；總膽紅素（TBIL）、總膽汁酸（TBA）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（日本和光純藥株式會社）；其余試劑均為分析純。

1.3動物

清潔級SD大鼠60只，♀，體質量180～200 g，由浙江省實驗動物中心提供[生產許可證號：SCXK（浙）2014-0001]。大鼠飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心[使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0042]，飼養環境室溫為20～25℃、相對濕度為40%～70%，飼養期間自由飲水、攝食。將大鼠適應性飼養1周后用于實驗。

2　方法

2.1分組、給藥與造模

將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組（熊去氧膽酸，0.045 g/kg，成人臨床用量的等效劑量）和YHA高、中、低劑量組[37.8、18.9、9.45 g（生藥）/kg，分別為成人臨床用量的2、1、0.5倍劑量]，每組10只。各給藥組大鼠ig相應藥物，空白組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續5 d。于第3天給藥后，除空白組外，其余各組大鼠均單次ig給予4%α-異硫氰酸萘酯溶液（2.5 ml/kg）復制急性肝內膽汁淤積模型（給藥前大鼠禁食12h）[4]。

2.2檢測指標

2.2.12 h膽汁流量檢測末次給藥后1 h，10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉大鼠，仰位固定，沿腹中線切開，于十二指腸處定位膽管并剝離周圍組織，備線，膽管切口，插入聚乙烯管，止血鉗夾閉傷口，覆蓋生理鹽水濕潤的紗布，收集2 h膽汁。用預先稱質量并編號的EP管，按規定時間間隔收集2 h內膽汁，膽汁流量用差重法求得：膽汁流量（g）＝含膽汁EP管質量（g）－空白EP管質量（g）。

2.2.2生化指標檢測在膽管插管前，于大鼠眼眶取血，置于EP管中輕搖，4℃過夜，以1 000×g離心20 min，收集上層血清。以全自動生化分析儀檢測血清中TBIL、TBA、ALT、AST和ALP水平。

2.2.3病理觀察在膽汁收集完成后，處死大鼠，切取肝臟左外側葉，0.1%甲醛固定，常規方法制備組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色。觀察組織脂肪細胞變性、炎性細胞浸潤和結締組織增生情況。

2.3統計學方法

3　結果

3.1各組大鼠2h膽汁流量及血清生化指標檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠2 h膽汁流量顯著減少，血清中ALT、AST、ALP、TBIL、TBA水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠2 h膽汁流量均不同程度增加、血清中上述生化指標均有不同程度降低；除陽性組和YHA中、低劑量組大鼠血清中ALP水平以及YHA低劑量組大鼠血清中TBIL水平降低不顯著外（P＞0.05），其余各組大鼠上述指標差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠2 h膽汁流量和血清生化指標檢測結果見表1。

表1　各組大鼠2h膽汁流量和血清生化指標檢測結果（±s，n＝10）Tab 1　2h volume of bile and serum liver function index of rats in each group（±s，n＝10）

表1　各組大鼠2h膽汁流量和血清生化指標檢測結果（±s，n＝10）Tab 1　2h volume of bile and serum liver function index of rats in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組陽性組YHA高劑量組YHA中劑量組YHA低劑量組2 h膽汁流量，g 0.605±0.050 0.360±0.080＊0.574±0.078##0.551±0.122##0.478±0.100#0.446±0.102#血清生化指標ALT，U/L 76.12±13.30 418.11±48.17＊248.65±69.44##230.19±86.97##317.27±73.12##339.48±63.79##AST，U/L 242.26±54.66 618.94±127.71＊418.66±110.80##372.12±101.72#463.89±113.43##502.50±105.88##ALP，U/L 185.50±18.11 259.00±20.47＊238.20±32.51 211.10±24.83##243.80±31.05 249.80±26.91 TBIL，μmol/L 1.03±0.64 85.11±11.69＊71.69±9.04#57.49±9.12##64.07±14.00##80.72±15.33 TBA，μmol/L 8.73±2.91 221.89±44.02＊171.37±27.29##175.27±37.21##183.51±23.48#192.21±29.81#

3.2各組大鼠肝組織病理觀察結果

空白組大鼠肝臟組織正常，無病變。模型組大鼠肝臟可見細胞輕度脂肪變性、中度炎細胞浸潤及纖維結締組織輕度增生等癥狀。給藥后，陽性組和YHA高劑量組大鼠肝臟變化最為明顯，肝臟組織僅存在輕度脂肪變性和輕度炎性細胞浸潤。YHA中、低劑量組變化較小，YHA中劑量組大鼠肝臟可見細胞輕度脂肪變性、中度炎細胞浸潤及纖維結締組織輕度增生等癥狀；YHA低劑量組大鼠肝臟組織病變較模型組無明顯變化。各組大鼠肝組織病理觀察結果見圖1。

4　討論

圖1　各組大鼠肝組織病理觀察結果（HE，×200）Fig 1　Liver tissue pathology of rats in each group（HE，×200）

膽汁淤積是妊娠期常見疾病，主要由肝細胞及毛細膽管膽汁分泌功能障礙或肝內膽小管彌散性梗阻引起，以妊娠期出現皮膚搔癢及黃疸為特點，可導致胎兒宮內窘迫、早產、新生兒缺氧窒息、死胎及死產[5-6]。現代醫學研究發現，膽汁淤積的發生與多種因素有關（比如感染、藥物、免疫、遺傳、妊娠等），但其具體發病機制仍不清楚。傳統醫學認為，膽汁淤積的發生與肝郁脾虛、氣滯瘀阻、肝膽濕熱蘊積有關，見于中醫“黃疸”“妊娠身癢”“胎死腹中”等病證。茵黃合劑是基于中醫“腎主生殖”“肝主疏泄”的理論而擬的具有補腎安胎、化瘀利膽功效的臨床驗方。方中以杜仲補腎安胎，丹參、郁金養血和血、行氣通瘀，共為君藥；茵陳以清利濕熱、利膽退黃，白蘚皮去風止癢，共為佐藥；諸藥相合，共奏補腎安胎、通瘀利膽、健脾化濕之效[7]。

α-異硫氰酸萘酯是公認的急性膽汁淤積模型誘導劑，其引發的膽汁淤積模型在病理上主要表現為肝實質細胞和膽管上皮細胞損傷、膽汁淤積、在匯管區可見炎細胞浸潤，與膽汁淤積癥臨床觀察結果的相似性較高[8]。熊去氧膽酸為一種親水性膽汁酸，很早以前我國中醫就將其應用于多種肝病的治療。其除了具有改變膽汁酸組成、保護肝細胞膜、調節免疫、抗氧化、增加膽汁中碳酸氫鹽等作用外，還具有促進受損肝細胞膽汁分泌、抑制肝細胞凋亡和細胞保護等作用[9]，故在本文中筆者以其為陽性對照藥物。

本研究結果顯示，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP水平升高，以及因肝細胞膽汁生成功能障礙（2 h膽汁流量明顯減少）而導致的血清中TBIL和TBA的利用減少。過高的膽汁酸可誘導心肌細胞、肝臟細胞、腎臟細胞發生凋亡和壞死，并可抑制線粒體Na+-K+-ATP酶而導致呼吸鏈功能異常。高濃度的膽紅素可加重膽汁酸的細胞毒性[10-11]。YHA高、中劑量可顯著改善α-異硫氰酸萘酯誘導的肝臟損傷、恢復肝臟功能、促進膽汁的合成和分泌，表現為2 h膽汁流量增加和血清中TBIL、TBA水平降低，以及病理組織學的明顯改善，并且高劑量YHA作用與陽性藥物熊去氧膽酸作用接近。本實驗結果證實了YHA對α-異硫氰酸萘酯致大鼠肝內膽淤積及肝功能具有一定改善作用，但其作用的具體機制尚不明確，有待進一步研究。

[1]張悅.茵黃合劑與熊去氧膽酸治療妊娠期肝內膽汁郁積癥的療效比較研究[J].黑龍江醫藥，2012，25（6）：840.

[2]趙翠英，陳靜琴，陳華，等.茵黃合劑治療妊娠肝內膽汁郁積癥的臨床研究：附100例療效觀察[J].江蘇中醫，2000，21（3）：8.

[3] 侯莉莉，夏衛軍.茵黃合劑對雌激素誘導肝內膽汁瘀積大鼠血生化的影響[J].遼寧中醫藥大學學報，2009，11（12）：165.

[4]姚嘉明，于芳芳，王小奇，等.清熱化濕疏肝祛瘀法對急性肝內膽汁淤積大鼠的防治作用[J].中華中醫藥學刊，2012，30（10）：2251.

[5]楊弟芳.妊娠期肝內膽汁淤積癥的發病機制[J].現代醫藥衛生，2005，21（13）：1667.

[6]王宇宏，狄英波，劉穎.妊娠期肝內膽汁淤積癥的病因研究進展[J].中國婦幼保健，2007，22（29）：4197.

[7]劉學華，陸茵，陳震.茵黃合劑治療妊娠肝內膽汁郁積癥的實驗研究[J].江蘇中醫，2000，21（7）：39.

[8]Korolenko TA，Savchenko NG，Yuz'ko JV，et al.Activity of lysosomal enzymes in the bile and serum of mice with intrahepatic cholestasis[J].Bull Exp Biol Med，2008，145（5）：560.

[9]陳建清，胡良凱，張建民.熊去氧膽酸在膽汁淤積性肝病中的應用[J].國際消化病雜志，2008，28（6）：474.

[10]胡玉芹，潘石蕾.妊娠期肝內膽汁淤積癥研究進展[J].中國婦產科臨床雜志，2009，10（4）：315.

[11] 張百明，趙致臻.玉米須提取物對膽汁淤積性肝病的改善作用研究[J].中國藥房，2010，21（23）：2130.

（編輯：林靜）

Improvement Effects of Yinhuang Mixture Extract on Biliation and Liver Function of Intrahepatic Cholestasis Model Rats

XI Mingming1，WANG Li1，TANG Qian1，ZHANG Qichun2，GU Wei1（1.Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210004，China；2.School of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210029，China）

OBJECTIVE：To investigate the improvement effects of Yinhuang mixture extract（YHA）on biliation and liver function of intrahepatic cholestasis model rats.METHODS：SD rats were randomly divided into blank group，model group，positive group（ursodesoxycholic acid，45 mg/kg）and YHA high-dose，medium-dose and low-dose groups[37.8，18.9，9.45 g（crude drug）/kg]，with 10 rats in each group.Treatment groups were given relevant medicine intragastrically，and blank group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 5 d.3 d after administration，except for blank group，those groups were given α-naphthyl isothiocyanates intragastrically to induce intrahepatic cholestasis model.1 h after last administration，2 h volume of bile，serum levels of TBIL，TBA，ALT，AST and ALP were detected；pathological changes of liver were observed.RESULTS：Compared with blank group，the 2 h volume of bile decreased significantly in model group，and serum levels of TBIL，TBA，ALT，AST and ALP increased significantly（P＜0.01）.The pathological injury was found in liver tissue.Compared with model group，except for serum level of ALP in positive group，YHA low-dose and medium-dose groups and serum level of TBIL in YHA low-dose group，another indexes of other treatment groups were improved significantly（P＜0.05 or P＜0.01）.Except for YHA low-dose group，pathological injure of other treatment groups were improved significantly. CONCLUSIONS：YHA can improve the biliation and liver function of rats with intrahepatic cholestasis induced by α-naphthyl isothiocyanates.

Yinhuang mixture extract；Intrahepatic cholestasis；Liver function；Biliation；α-naphthyl isothiocyanates；Rats

R962

A

1001-0408（2016）28-3936-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.14

南京市2013年度科技發展指導性計劃（藥學項目）（No.2013YX012）；南京市醫學科技發展項目（No.YKK13143）

＊副主任中藥師。研究方向：臨床藥學和制劑。電話：025-52226104。E-mail：xmm1976@163.com

副主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥學。電話：025-52226104。E-mail：helloguwei@126.com

（2016-03-10

2016-06-20）