片仔癀對小鼠結腸癌細胞增殖及肝轉移的抑制作用

鄭良樸，曹治云，陳旭征，林薇

（1.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122）

片仔癀對小鼠結腸癌細胞增殖及肝轉移的抑制作用

鄭良樸1，2，曹治云2，陳旭征2，林薇1，2

（1.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122）

目的觀察片仔癀對小鼠結腸癌細胞（CT26）增殖及肝轉移的抑制作用。方法用MTT法觀察片仔癀對CT26的增殖抑制作用，以BALB／c小鼠為研究對象，用脾臟注射法建立結腸癌CT26小鼠肝臟轉移瘤模型，隨機分為對照組、片仔癀組，觀察各組小鼠的生存狀態等一般情況，分析脾臟、肝臟成瘤情況，計算成瘤率。結果片仔癀對CT26增殖有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴關系；脾臟注射法成功建立CT26肝轉移的動物模型，成瘤率100%，1周內對小鼠一般情況沒有明顯影響；片仔癀能抑制CT 26肝轉移作用。結論脾臟注射法建立的CT26肝轉移小鼠模型可用于結腸癌肝轉移的研究，片仔癀對CT26增殖及肝轉移有明顯的抑制作用。

結腸癌；肝轉移；片仔癀；細胞增殖；小鼠模型

為觀察片仔癀對小鼠結腸癌細胞增殖及肝轉移的抑制作用，我們做體外實驗觀察片仔癀對小鼠結腸癌細胞增殖抑制作用。用脾臟注射法制作結腸癌細胞肝轉移的小鼠模型，觀察片仔癀對小鼠結腸癌肝轉移的抑制作用。片仔癀是有著400多年歷史的中成藥，由三七、麝香、牛黃、蛇膽等組成，具有清熱解毒、散瘀止血、消腫定痛的功效，現已在消化道腫瘤等方面應用，有較好的療效［1］，希望通過本實驗為其臨床應用提供實驗依據。

1　實驗材料

1.1實驗儀器超凈工作臺（江蘇省蘇州凈化設備公司）；CO2培養箱（德國Heraeus公司）；IX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；SXP-1C手術顯微鏡（上海醫光儀器有限公司）；Elx808酶聯免疫分析儀（美國Bio-Tek公司）；ME204E電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）。

1.2藥品與試劑片仔癀片劑（漳州片仔癀藥業股份有限公司，規格：3 g／粒，批號：1203005）；5／0手術縫線（上海浦東金環醫療用品有限公司）；培養瓶、培養板（美國Coming公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、DMEM高糖培養液、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Hyclone公司）；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）干粉、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）。

1.3細胞株與動物小鼠結腸腺癌（CT26）細胞（中國科學院上海細胞庫）。SPF級BALB／c雄性小鼠14只，體質量20～22 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK（滬）2012-0002。

2　實驗方法

2.1藥物制備片仔癀片劑用研缽研成細粉，稱取1 000 mg片仔癀粉末，用50%DMSO配制成濃度為50 mg／mL的20 mL，高壓滅菌，4℃保存，待用于體外實驗；稱取3 000 mg片仔癀粉末，用雙蒸水配制成濃度為30 mg／mL的100 mL，高壓滅菌，4℃保存，待用于小鼠灌胃給藥。

2.2細胞培養CT26用含1O%FBS的DMEM高糖培養液，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，在倒置相差顯微鏡下對細胞形態變化進行觀察。

2.3CT26增殖抑制實驗取處于對數生長期的CT26細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，調整細胞懸液濃度接種于96孔培養板，每孔加入100 μL細胞懸液，細胞密度為5 000／孔。孵育16 h后，使細胞同步化，加入不同濃度的50%DMSO溶解片仔癀，4組給藥濃度為0、0.25、0.5、1 mg／mL，每組設8個復孔，以確保在培養體系中DMSO終濃度小于0.5%。繼續孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察。小心吸去孔內培養液，每孔加入100μLMTT溶液，MTT溶液濃度為0.5 mg／mL，繼續培養2 h。棄去MTT溶液，小心用PBS沖洗2遍后，每孔加入100μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫分析儀在570 nm處測量各孔的吸光度值（OD），計算抑制率。

2.4制作結腸癌細胞肝轉移的動物模型BALB／c雄性小鼠稱重，50 mg／kg體質量用1%的戊巴比妥鈉進行腹腔內注射麻醉。麻醉成功后，用膠布固定小鼠于手術臺上，安爾碘皮膚消毒，左側腋后線肋緣下縱行切口，切口長1 cm，進腹后于腹外側找到柳葉狀脾臟，用無齒鑷牽出腹腔外，用1 mL注射器從脾下極進針，注入指數生長期的CT26細胞液0.2 mL（約200 000個細胞），隨后拔出針，用酒精棉球按壓針眼，輕輕按揉脾臟5 min，使瘤細胞經脾靜脈進入肝臟。注射區蒼白隆起消失后，依次連續縫合肌肉、皮膚，關腹。術后在2級動物實驗室飼養、觀察。

2.5肝轉移的抑制實驗14只小鼠術后隨機分為對照組和片仔癀組，每組7只。術后第2天，用灌胃方式給藥，片仔癀組每只小鼠給片仔癀溶液每日1次，每次0.25 mL；空白組灌胃給等體積的飲用水。每日對小鼠毛發、大小便、活動等一般情況進行觀察，連續給藥7 d后，脫頸椎處死小鼠，剖腹觀察腫瘤生長以及肝轉移情況。

2.6統計學處理計量數據用x±s表示，用SPSS 13.0統計軟件進行分析，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3　實驗結果

3.1實驗結果見表1、表2。

表1　片仔癀對CT26增殖抑制作用（x±s）

表2　片仔癀對脾臟注射CT26肝轉移的作用

片仔癀對小鼠結腸癌細胞CT26有明顯抑制作用，抑制率隨著藥物濃度增大而增大，差異具有統計學意義。2組小鼠的脾臟均有腫瘤形成，但腹腔未見腫大淋巴結。對照組6只小鼠肝臟中發現腫瘤結節，轉移率為100%。片仔癀組中有2只小鼠肝臟中發現腫瘤結節，轉移率為28.6%。

3.2一般觀察動物造模后，隨機分為對照組和片仔癀組，手術當日對照組小鼠死亡1只，解剖小鼠，分析死亡原因，屬麻醉異常致小鼠死亡。后7天實驗中，2組大鼠未見明顯異常，飲食、活動等狀況良好。

4　討論

4.1結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年超過100萬人診斷為結直腸癌，我國的結直腸癌發病率也呈逐年上升趨勢［2-3］。結腸癌轉移途徑主要有血行轉移、腹膜轉移和淋巴結轉移等，最常轉移的器官是肝臟，而結直腸癌肝轉移患者預后極差。因此，建立轉移性結直腸癌動物模型是研究結直腸癌轉移機制及抗腫瘤藥物篩選的重要工具［4］。在結腸癌轉移動物模型的研究中，由于人癌細胞難以在普通小鼠中生長，對模型動物及瘤源選擇是作為重要因素進行選擇。癌細胞脾臟內種植是目前研究腫瘤肝臟轉移的最佳模式之一，CT26細胞具有較強侵襲能力，BALB／c小鼠常作為研究腫瘤肝臟轉移的模型動物。本實驗選用BALB／c小鼠作為模型動物，用具有轉移高潛力CT26細胞作為瘤源細胞株進行脾臟注射方式造模，實驗結果表明，脾臟注射法建立CT26肝轉移的動物模型成瘤率達100%，可作為轉移性結直腸癌的理想動物模型。

4.2中草藥具有明顯的腫瘤抑制作用［5－7］。本實驗用MTT法觀察片仔癀對CT26增殖抑制作用，實驗結果表明，片仔癀對CT26有明顯抑制作用，抑制率隨著藥物濃度增大而增大，呈劑量依賴關系；同時在片仔癀抑制CT26肝轉移的實驗中，片仔癀組明顯低于對照組，轉移率僅為28.6%。相關研究也表明，片仔癀對人結腸癌細胞和人臍靜脈內皮細胞生長和增殖有明顯抑制作用。抑制腫瘤細胞生長和增殖是抑制腫瘤轉移作用機制之一，片仔癀如何通過抑制腫瘤細胞生長和增殖達到抑制CT26肝轉移，還有待進一步研究。

［1］劉叢盛.片仔癀藥理及臨床應用綜述［J］.醫藥世界，2006，8（S2）：64-65.

［2］SIEGEL R，MA J，ZOU Z H，et al.Cancer Statistics，2014［J］. Ca Cancer JClin，2014，64（2）：9-29.

［3］陳瓊，劉志才，程蘭平，等.2003～2007年中國結直腸癌發病與死亡分析［J］.中國腫瘤，2012，21（3）：179-182.

［4］孫鈺，嚴卿瑩，阮善明，等.轉移性結直腸癌動物模型的研究進展［J］.腫瘤學雜志，2015，21（4）：335-339.

［5］魏麗慧，林久茂，彭軍，等.片仔癀對人結腸癌細胞增殖的影響［J］.福建中醫藥，2010，41（1）：56-58.

［6］林薇，趙錦燕，鄭良樸，等.片仔癀對人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移的影響［J］.福建中醫藥大學學報，2011，21（1）：25-27.

［7］靳祎祎，李瓊瑜，賴子君，等.白花蛇舌草通過調控Hedgehog通路增加大腸癌耐藥細胞的藥物蓄積研究［J］.康復學報，2016，26（3）：34-39.

R285.5

B

1000-338X（2016）05-0016-02

2016-06-28

福建省自然科學基金資助課題（2014J013959、2015J01336）

鄭良樸（1974—），男，高級實驗師，主要從事中西醫結合基礎研究。

林薇（1974—），女，副研究員。E-mail：linwei3116@126.com