意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)飼糧的適宜亞硒酸鈉添加水平

蘇中渠，張衛(wèi)星，郗學(xué)鵬，王紅芳，胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)飼糧的適宜亞硒酸鈉添加水平

蘇中渠，張衛(wèi)星，郗學(xué)鵬，王紅芳，胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

【目的】探索意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）工蜂幼蟲(chóng)日糧的適宜亞硒酸鈉水平，為意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)發(fā)育階段硒的營(yíng)養(yǎng)需要提供依據(jù)。【方法】共取1 440只1日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)并平均分為兩批，每批720只，一批用于化蛹率、羽化率的測(cè)定，一批用于理化指標(biāo)和分子指標(biāo)的測(cè)定。兩批幼蟲(chóng)均按單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分成6組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組分別飼喂亞硒酸鈉添加量為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·kg-1的日糧，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24只幼蟲(chóng)。取3、5、7日齡幼蟲(chóng)測(cè)定體重、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、酚氧化酶（phenoloxidase，PO）活性，取5日齡幼蟲(chóng)測(cè)定硒磷酸合成酶（selenide water dikinase，SelD）、絲氨酰-tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRs）、SECIS-結(jié)合蛋白1（SECIS-binding protein 1，Sbp1）、SECIS-結(jié)合蛋白2（SECIS-binding protein 2，Sbp2）基因表達(dá)量；7日齡時(shí)統(tǒng)計(jì)化蛹率。【結(jié)果】與對(duì)照組相比，日糧添加亞硒酸鈉水平為0.2—0.6 mg·kg-1時(shí)顯著提高了幼蟲(chóng)的T-AOC（P＜0.05），日糧添加亞硒酸鈉水平為0.2—0.8 mg·kg-1時(shí)顯著提高了幼蟲(chóng)的T-SOD活性（P＜0.05），各試驗(yàn)組均顯著降低了幼蟲(chóng)的MDA含量（P＜0.05）。日糧添加亞硒酸鈉水平為0.4 mg·kg-1時(shí)幼蟲(chóng)的PO活性顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。日糧添加亞硒酸鈉水平為0.6 mg·kg-1時(shí)5日齡幼蟲(chóng)的SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。日糧添加亞硒酸鈉水平為0.4 mg·kg-1時(shí)幼蟲(chóng)化蛹前體重顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，日糧添加亞硒酸鈉水平為0.2 mg·kg-1時(shí)，幼蟲(chóng)化蛹率顯著提高（P＜0.05）。【結(jié)論】人工飼養(yǎng)條件下基礎(chǔ)日糧硒水平為0.21 mg·kg-1時(shí)，根據(jù)幼蟲(chóng)化蛹前體重、化蛹率做擬合曲線得出意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)日糧適宜亞硒酸鈉添加水平為0.24—0.33 mg·kg-1，即意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)的適宜硒水平為0.32—0.36 mg·kg-1。

意大利蜜蜂；工蜂幼蟲(chóng)；亞硒酸鈉；適宜添加水平

0 引言

【研究意義】在昆蟲(chóng)生理學(xué)中硒被認(rèn)為具有重要作用［1］。研究表明硒元素是對(duì)生長(zhǎng)、發(fā)育、抗癌和免疫都有作用的重要微量元素［2-3］，因此，研究蜜蜂對(duì)硒的營(yíng)養(yǎng)需要量對(duì)蜜蜂的健康養(yǎng)殖具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外大量研究表明，畜禽及昆蟲(chóng)日糧添加硒對(duì)機(jī)體具有有益影響。ROTRUCK等［4］證明硒在細(xì)胞抗氧化作用中占據(jù)重要地位；MARTINROMERO等［5］發(fā)現(xiàn)用含硒量10 nmol·L-1—1 μmol·L-1的培養(yǎng)基飼養(yǎng)果蠅，其存活率比對(duì)照組提高約一倍，并且日糧添加硒能顯著提高果蠅繁殖能力。同時(shí)，有研究認(rèn)為硒攝入不足會(huì)降低鱗翅目幼蟲(chóng)的免疫力［6］，而酚氧化酶與蜜蜂的免疫密切相關(guān)［7］，可作為蜜蜂免疫的重要指標(biāo)。另外，在特定時(shí)期，硒對(duì)蠶幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)及生理狀態(tài)均有益［8］。富硒食物飼養(yǎng)的黃粉蟲(chóng)可抵抗更低的溫度［9］。硒蛋白是硒元素在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮功能的關(guān)鍵，ALLMANG等［10］描述的真核生物硒代謝通路中絲氨酰-tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRs）、硒磷酸合成酶（selenide water dikinase，SelD）、SECIS-結(jié)合蛋白2（SECIS-binding protein 2，Sbp2）基因在合成硒蛋白的過(guò)程中起重要作用。SerRs的作用是合成tRNASer，tRNASer是合成tRNASec的前體物質(zhì)；SelD是Sec-tRNASec的組成部分；Sbp2是硒蛋白合成過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，作用是與硒蛋白mRNA上的SECIS片段以及核糖體結(jié)合，并且其N端被預(yù)測(cè)有核定位信號(hào)，能穿梭核質(zhì)［11-18］。SECIS-結(jié)合蛋白1（SECIS-binding protein 1，Sbp1）在人類研究中上被認(rèn)為是抑癌作用的重要載體，但在昆蟲(chóng)中的作用尚不明確?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）是國(guó)際飼養(yǎng)最廣泛的西方蜜蜂亞種，目前，硒對(duì)意大利蜜蜂的營(yíng)養(yǎng)作用研究較少，其幼蟲(chóng)對(duì)硒的營(yíng)養(yǎng)需要更是未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究日糧硒水平對(duì)意大利蜜蜂幼蟲(chóng)抗氧化能力、免疫性能、硒蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)水平、化蛹前體重以及化蛹率的影響，探明意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)日糧亞硒酸鈉的適宜添加水平。

1 材料與方法

試驗(yàn)用意大利蜜蜂蜂群飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)蜂場(chǎng)，試驗(yàn)用幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)及生理生化指標(biāo)的測(cè)定均于2015年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1 日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)和新鮮蜂王漿取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)蜂場(chǎng)。亞硒酸鈉（AR級(jí)，貨號(hào)1021133）由西亞試劑公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與日糧配方

選取蜂王遺傳背景相似、群勢(shì)相當(dāng)?shù)姆淙鹤鳛榻忝猛跞?，在姐妹王群中共? 440只1日齡蜜蜂幼蟲(chóng)，720只用于化蛹率、羽化率的測(cè)定，另外720只用于酶活性測(cè)定。試驗(yàn)幼蟲(chóng)均按單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分別分成6組。日糧中添加的亞硒酸鈉水平分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·kg-1，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24只。對(duì)照組參照VANDENBERG等［19］的配方配制基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在其基礎(chǔ)上添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·kg-1的亞硒酸鈉，幼蟲(chóng)飼糧組成見(jiàn)表1。

表1 幼蟲(chóng)日糧配方Table1 Compositions of larval recipe

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前向巢箱內(nèi)靠近蜂王巢脾的位置放入1張空脾，將蜂王限制在此位置產(chǎn)卵。12—18 h后提出加入的空脾并檢查產(chǎn)卵情況，產(chǎn)卵量符合要求即可提入繼箱進(jìn)行孵化，卵期一般為3 d。第4天將孵化的1日齡幼蟲(chóng)用移蟲(chóng)針移至預(yù)熱好的加入了200 μL飼糧的人工王臺(tái)內(nèi)，飼養(yǎng)于溫度34.5℃，相對(duì)濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中，每天更換日糧。飼養(yǎng)至第6天末或第7天初的時(shí)候，幼蟲(chóng)開(kāi)始直立或排便。將其轉(zhuǎn)移至提前放置好滅菌王臺(tái)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)準(zhǔn)備化蛹。蛹期溫度34.5℃，相對(duì)濕度為75%。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 幼蟲(chóng)抗氧化酶活性 將取出的3、5、7日齡的幼蟲(chóng)，按質(zhì)量體積比制備成10%的組織勻漿，4℃離心機(jī)2 500 r/min離心10 min，吸取上清。制備1%的組織勻漿，黃嘌呤氧化法測(cè)定總超氧化物歧化酶活性（T-SOD）；10%的組織勻漿用Fe3+還原法測(cè)定總抗氧化能力（T-AOC），硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定丙二醛（MDA），試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，使用UV-2450紫外分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4.2 幼蟲(chóng)酚氧化酶 隨機(jī)取5日齡和7日齡的幼蟲(chóng)，每組5個(gè)重復(fù)，用毛細(xì)管取其血淋巴共40 μL，加入少許苯基硫脲（防止血淋巴氧化），-80℃保存。測(cè)定時(shí)取出化凍離心，雙抗體夾心法測(cè)定酚氧化酶（PO）水平，試劑盒購(gòu)自上海郎頓生物技術(shù)有限公司，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.4.3 5日齡幼蟲(chóng)SerRs、SelD、Sbp1、Sbp2基因表達(dá)水平 隨機(jī)取5日齡幼蟲(chóng)，采用在低溫條件下用全自動(dòng)樣品快速破碎儀進(jìn)行組織破碎，使用Total RNA Kit試劑盒（OMEGA，USA）提取蜜蜂總RNA，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche，USA）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存待用。參照FastStart Universal SYBR Green Master（Roche，USA）試劑盒的說(shuō)明書(shū)配置20 μL體系，ABI 7500系統(tǒng)測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)量。定量引物的設(shè)計(jì)及合成均由上海生工生物有限公司完成，引物信息見(jiàn)表2。

表2 基因引物序列Table2 Sequences of gene primers

1.4.4 幼蟲(chóng)體重 每組隨機(jī)取3、5、7日齡的幼蟲(chóng)放入已稱重的1.5 mL離心管內(nèi)，電子天平稱重（精確至0.0001 g），計(jì)算幼蟲(chóng)體重，每組5個(gè)重復(fù)，之后樣品存于-80℃冰箱，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.4.5 化蛹率 用于測(cè)定此指標(biāo)的幼蟲(chóng)從第1天飼養(yǎng)至第7天的過(guò)程中每天檢查記錄幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)狀況，將已死亡個(gè)體移出，記錄至全部化蛹為止，根據(jù)存活個(gè)體計(jì)算幼蟲(chóng)化蛹率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用Duncan氏法，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，數(shù)據(jù)均用“mean±SD”的格式表示。

表3 飼糧亞硒酸鈉添加水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)總抗氧化能力的影響Table3 Effects of diets sodium selenite supplementation on the T-AOC of A. m. ligustica worker larval

表4 飼糧亞硒酸鈉添加水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)總超氧化物歧化酶活力的影響Table4 Effects of diets sodium selenite supplementation on the T-SOD activities of A. m. ligustica worker larval

2 結(jié)果

2.1 飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)抗氧化能力的影響

2.1.1 對(duì)工蜂幼蟲(chóng)總抗氧化能力的影響 日糧添加0.2—1.0 mg·kg-1亞硒酸鈉對(duì)3日齡幼蟲(chóng)的總抗氧化能力（T-AOC）均有提高的作用（P＜0.05），且隨著添加水平的增加3日齡幼蟲(chóng)的T-AOC呈上升趨勢(shì)，其中添加1.0 mg·kg-1亞硒酸鈉時(shí)，3日齡幼蟲(chóng)的T-AOC最高（P＜0.05），0.8 mg·kg-1添加組次之，0.2、0.4、0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）；5日齡幼蟲(chóng)的T-AOC隨著亞硒酸鈉添加水平的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，添加0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組T-AOC顯著高于各試驗(yàn)組及對(duì)照組（P＜0.05），添加0.2和0.6 mg·kg-1的組次之，二者差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），0.8和1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05），顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（表3）。

2.1.2 對(duì)工蜂幼蟲(chóng)總超氧化物歧化酶活力的影響添加水平為0.2 、0.4 、0.6、0.8 mg·kg-1的試驗(yàn)組提高了3日齡幼蟲(chóng)的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性，顯著高于對(duì)照組和添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05），添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。5、7日齡幼蟲(chóng)與3日齡結(jié)果一致（表4）。

2.1.3 對(duì)工蜂幼蟲(chóng)丙二醛含量的影響 日糧亞硒酸鈉水平顯著地影響了3、5、7日齡幼蟲(chóng)的丙二醛（MDA）含量（P＜0.05）。3日齡幼蟲(chóng)對(duì)照組MDA含量顯著高于各試驗(yàn)組（P＜0.05），添加水平為0.4、0.6、0.8 mg·kg-1的試驗(yàn)組MDA含量差異不顯著（P＞0.05），顯著低于硒添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05），0.2 mg·kg-1的試驗(yàn)組與添加水平為0.4、0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05），顯著高于添加水平為0.8 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05）；5日齡幼蟲(chóng)對(duì)照組MDA含量顯著高于各試驗(yàn)組（P＜0.05），添加水平為0.2、0.4、0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組MDA含量顯著低于添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05），3個(gè)添加水平間差異不顯著（P＞0.05），添加水平為0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組MDA含量顯著低于添加水平為0.8 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05）；7日齡幼蟲(chóng)對(duì)照組MDA含量顯著地高于各試驗(yàn)組（P＜0.05），添加水平為0.2、0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組MDA含量顯著低于添加水平為0.8、1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05），與添加水平為0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05）（表5）。

表5 飼糧亞硒酸鈉添加水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)丙二醛含量的影響Table5 Effects of diets sodium selenite supplementation on the MDA content of A. m. ligustica worker larval

2.2 飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)5、7日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)免疫能力的影響

日糧亞硒酸鈉水平顯著地影響了5、7日齡幼蟲(chóng)的酚氧化酶（PO）活性（P＜0.05）。幼蟲(chóng)生長(zhǎng)至5日齡時(shí)，添加水平為0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組PO活性最高，1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組PO活性最低，添加水平為0.8 mg·kg-1的組顯著低于0.2和0.4 mg·kg-1組（P＜0.05），但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；7日齡幼蟲(chóng)添加水平為0.4 mg·kg-1的組PO活性顯著高于其余各組（P＜0.05），添加水平0.2和0.6 mg·kg-1的組顯著高于0.8 mg·kg-1的組（P＜0.05），但與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05），1.0 mg·kg-1的組PO活性最低（表6）。

表6 飼糧亞硒酸鈉添加水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)酚氧化酶活性的影響Table6 Effects of diets sodium selenite supplementation on the PO activity of A. m. ligustica worker larval

2.3 飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)5日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達(dá)水平的影響

隨著亞硒酸鈉添加水平的增加，對(duì)5日齡幼蟲(chóng)SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達(dá)量有顯著影響（P＜0.05）。各試驗(yàn)組的SelD基因與對(duì)照組表達(dá)量差異顯著（P＜0.05），添加量為0.2 mg·kg-1的組顯著低于其余試驗(yàn)組（P＜0.05），其余各組間差異不顯著（P＞0.05）；各試驗(yàn)組Sbp2基因總體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，1.0 mg·kg-1的組顯著高于除0.6 mg·kg-1的其余試驗(yàn)組（P＜0.05），0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），與0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05），對(duì)照組與0.2、0.4和0.8 mg·kg-1的試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05）；0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組SerRs基因顯著高于除0.4和1.0 mg·kg-1的其余各試驗(yàn)組（P＜0.05），除0.4 mg·kg-1以外其余各試驗(yàn)組與對(duì)照差異不顯著（P＞0.05）；0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組Sbp1基因顯著高于其余試驗(yàn)組（P＜0.05），對(duì)照組與0.8和1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05），顯著低于0.2和0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05）（圖1）。

2.4 飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)體重的影響

幼蟲(chóng)飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)3、5、7日齡幼蟲(chóng)體重有顯著影響（P＜0.05）。亞硒酸鈉添加水平為0.2 mg·kg-1的試驗(yàn)組3日齡幼蟲(chóng)體重顯著高于添加1.0 mg·kg-1試驗(yàn)組（P＜0.05），對(duì)照組與各試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）。幼蟲(chóng)生長(zhǎng)至5日齡后，隨著添加水平的提高，幼蟲(chóng)體重呈現(xiàn)出先上升后下降的總體趨勢(shì)，0.2 mg·kg-1的試驗(yàn)組體重顯著高于對(duì)照組和其余各試驗(yàn)組（P＜0.05），0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），其余各試驗(yàn)組顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。幼蟲(chóng)飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)7日齡幼蟲(chóng)體重影響顯著（P＜0.05），添加水平為0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組體重顯著高于空白組和其他試驗(yàn)組（P＜0.05），添加水平為0.2、0.6 mg·kg-1的試驗(yàn)組對(duì)照組體重與差異不顯著（P＞0.05），顯著高于添加水平為0.8 mg·kg-1試驗(yàn)組（P＜0.05），添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組體重最低（圖2）。

2.5 飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)意大利蜜蜂工蜂化蛹率的影響

幼蟲(chóng)飼糧亞硒酸鈉水平對(duì)化蛹率有顯著的影響（P＜0.05）。硒添加水平為0.2 mg·kg-1的試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組與亞硒酸鈉添加水平為0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組化蛹率差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于添加水平為0.6和0.8 mg·kg-1的試驗(yàn)組（P＜0.05），硒添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗(yàn)組不能成功化蛹（圖3）。

圖1 5日齡幼蟲(chóng)SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達(dá)水平Fig. 1 SelD， SerRs， Sbp1， Sbp2 genes expression levels of 5-day-old larvae

圖2 不同日齡幼蟲(chóng)體重Fig. 2 The body weight of different days larvae

圖3 幼蟲(chóng)化蛹率Fig. 3 The pupation rate of larvae

3 討論

3.1 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對(duì)幼蟲(chóng)抗氧化性的影響

機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度有著密切的聯(lián)系，而硒可以影響動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力。T-AOC可反映機(jī)體總抗氧化能力的強(qiáng)弱；T-SOD可消除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷；MDA反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化物含量。硒是硒蛋白谷胱甘肽過(guò)氧化酶（glutathione-peroxidase，GSH-PX）活性中心的重要組成部分，缺硒會(huì)導(dǎo)致GSH-PX活性降低及合成受阻，本試驗(yàn)沒(méi)能測(cè)定出蜜蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)的GSH-PX，原因可能是蜜蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)GSH-PX含量較低，不在所用試劑盒（南京建成）測(cè)定范圍內(nèi)。本試驗(yàn)結(jié)果與張艷艷等［20］所測(cè)的結(jié)果一致，動(dòng)物缺硒會(huì)使機(jī)體合成抗氧化酶的能力下降，從而使機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，導(dǎo)致自由基水平和MDA含量升高［21］。隨著硒含量的添加，機(jī)體MDA含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這是因?yàn)闄C(jī)體添加適量硒后抗氧化性逐漸增強(qiáng)，清除氧自由基的能力提升，MDA含量下降；而當(dāng)硒過(guò)量后，硒取代蛋白質(zhì)內(nèi)的硫元素，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用，降低機(jī)體抗氧化性，MDA含量上升。

本研究表明，日糧添加硒可以提高意大利蜜蜂幼蟲(chóng)的總抗氧化能力以及SOD活力，同時(shí)降低了機(jī)體的MDA含量，這說(shuō)明日糧添加硒可能影響到了其GSH-PX的活性與合成。

3.2 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對(duì)幼蟲(chóng)免疫性能的影響

PO是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的酶，其生成的活性物質(zhì)是微生物細(xì)胞破壞作用的重要部分［22-24］，且其在昆蟲(chóng)的體液和細(xì)胞免疫中具有重要作用，該酶主要參與昆蟲(chóng)的表皮硬化、微生物黑化包被［25］以及傷口的愈合過(guò)程。

王寶維等［26］發(fā)現(xiàn)硒可以促進(jìn)鵝免疫器官的生長(zhǎng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫；林玉才等［27］的研究指出硒缺乏會(huì)導(dǎo)致雛雞免疫器官發(fā)育不良，機(jī)體免疫功能下降。硒攝入不足對(duì)鱗翅目幼蟲(chóng)具有抑制免疫的作用，可以提升機(jī)體感染微生物的概率，而微生物感染與昆蟲(chóng)體內(nèi)的PO活性密切相關(guān)［5］。本研究表明，日糧添加適量硒可以顯著提高意大利蜜蜂幼蟲(chóng)的酚氧化酶活性，說(shuō)明硒可以增強(qiáng)幼蟲(chóng)免疫能力，保證機(jī)體的健康生長(zhǎng)。

3.3 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對(duì)幼蟲(chóng)SerRs、SelD、Sbp1、Sbp2基因表達(dá)水平的影響

本研究表明，隨著硒水平的升高，SerRs水平也升高，0.6 mg·kg-1的時(shí)候表達(dá)量達(dá)到最高；而SelD基因表達(dá)量也是隨著硒水平的增大升高，0.4 mg·kg-1表達(dá)量最高；Sbp2的表達(dá)量隨著硒添加量的增加一直在升高，添加1.0 mg·kg-1的組有最高表達(dá)量，說(shuō)明蜜蜂合成硒蛋白所用通路可能與古生菌、哺乳動(dòng)物的硒代謝通路有相似之處，均會(huì)用到絲氨酸的tRNA作為Sec-tRNASec的前體物質(zhì)，且SelD與Sbp2均參與了意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)硒蛋白的合成。Sbp1隨著硒添加水平的增加也在增加，在0.6 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最大值，但其對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲(chóng)的作用目前尚不明了，試驗(yàn)結(jié)果與果蠅上類似［5］。

3.4 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對(duì)幼蟲(chóng)體重的影響

黎觀紅等［28］發(fā)現(xiàn)日糧硒添加水平為0.10—0.50 mg·kg-1時(shí)可以顯著提高泰和烏骨雞的日增重及降低料重比；王寶維等［26］發(fā)現(xiàn)日糧添加硒源可以提高鵝各階段的體增重；CANTOR等［29］研究表明日糧添加硒代蛋氨酸或亞硒酸鈉可提高4周齡火雞的體重和采食量，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；張艷艷等［20］的研究發(fā)現(xiàn)2—3月齡的生長(zhǎng)肉兔日糧內(nèi)添加0.15 mg·kg-1的硒后可增加其平均日增重。

幼蟲(chóng)階段是蜜蜂生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要階段，而幼蟲(chóng)體重可直觀地反映出幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育速度。本研究表明，添加適量的亞硒酸鈉可以促進(jìn)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)，但當(dāng)添加量高于0.4 mg·kg-1后幼蟲(chóng)體重顯著降低，說(shuō)明硒在蜜蜂體內(nèi)存在劑量效應(yīng)。添加0.6 mg·kg-1亞硒酸鈉的試驗(yàn)組5日齡幼蟲(chóng)體重與對(duì)照差異顯著，而7日齡差異不顯著的原因可能是因?yàn)槲鴮?duì)昆蟲(chóng)的毒性有延遲發(fā)育的作用，如煙芽夜蛾（Heliothis virescens）［30］和蛆癥異蚤蠅（Megaselia scalaris）［31］，至第7天此組可能才完成正常發(fā)育。

3.5 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對(duì)幼蟲(chóng)化蛹率的影響

昆蟲(chóng)需要硒這種微量營(yíng)養(yǎng)素來(lái)完善其多樣的生活史參數(shù)［5］。化蛹率和羽化率作為昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育的過(guò)程，是直接反應(yīng)幼蟲(chóng)發(fā)育狀況的重要指標(biāo)。本研究表明，添加適量的亞硒酸鈉可在一定程度上提高幼蟲(chóng)的化蛹率，而硒添加量高于0.4 mg·kg-1的試驗(yàn)組化蛹率顯著降低，甚至不能化蛹，這與HLADUN等［32］的結(jié)果有相似之處，原因是當(dāng)日糧硒過(guò)量后，硒可以取代像半胱氨酸和胱氨酸這類含硫氨基酸內(nèi)的硫并影響蛋白質(zhì)折疊，從而擾亂細(xì)胞代謝并導(dǎo)致畸形，導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育受到影響。

4 結(jié)論

人工飼養(yǎng)基礎(chǔ)日糧硒水平為0.21 mg·kg-1條件下，幼蟲(chóng)飼糧硒水平的不同可影響幼蟲(chóng)抗氧化性、免疫性能、硒蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)量化蛹率、化蛹前體重、化蛹率，且以亞硒酸鈉為硒源時(shí)，通過(guò)對(duì)幼蟲(chóng)化蛹前體重、化蛹率做擬合曲線，得出亞硒酸鈉適宜添加水平為0.24—0.33 mg·kg-1，亦即硒的適宜添加水平為0.32—0.36 mg·kg-1。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Appropriate Level of Sodium Selenite for Apis mellifera ligustica Worker Bee Larvae Feed

SU Zhong-qu， ZHANG Wei-xing， CHI Xue-peng， WANG Hong-fang， XU Bao-hua
（College of Animal Science and Technology， Shandong Agricultural University， Taian 271018， Shandong）

【Objective】The objective of this study is to find an appropriate level of sodium selenite which added in the food of Apis mellifera ligustica worker larvae， and to provide a theoretical basis for the nutritional needs of Se.【Method】A total of 1 440 one-day old larvae were randomly allotted into 2 batches， each batch involve 720 larvae， one of the batch was used to measure the pupation rate and eclosion rate， the other was used to measure enzyme activity and molecular index. Two batches were all randomly divided into 6 groups， the control group was fed basic diet and the treatment groups were fed different diets with sodium selenite at the levels of 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， and 1.0 mg·kg-1， respectively. Each group had 5 repetitions and involved 24 larvae in each. The 3-， 5-and 7-day-old larvae were used to measure larvae weight， T-AOC （total antioxidant capacity）， T-SOD （total superoxide dismutase），MDA （malondialdehyde）， and PO （phenoloxidase）. The gene expression of SelD， SerRs， Sbp1 and Sbp2 were measured by using 5-day-old larvae. The pupation rate was calculated at 7-day-old.【Result】Compared with the control group， when the added levels of sodium selenite were 0.2-0.6 mg·kg-1， the T-AOC was significantly increased （P＜0.05）， when the added levels of sodium selenite were 0.2-0.8 mg·kg-1， the activity of T-SOD was significantly increased （P＜0.05） and the MDA content of all the treatment groups was significantly decreased （P＜0.05）. When the added level of sodium selenite was 0.4 mg·kg-1， the activity of PO was significantly increased （P＜0.05）. When the added level of sodium selenite was 0.6 mg·kg-1， the gene expression levels of SelD， SerRs， Sbp1and Sbp2 was significantly higher than the control in 5-day-old larvae （P＜0.05）. When the added level of sodium selenite was 0.4 mg·kg-1， the weight before pupation was significantly higher than the control （P＜0.05）. Compared with the control group， when the added level of sodium selenite was 0.2 mg·kg-1， the pupation rate were significantly increased （P＜0.05）. 【Conclusion】Under artificial condition， when the selenium level of basic diet was 0.21 mg·kg-1， the appropriate level of sodium selenite which added in the food of A. m. ligustica worker larvae was 0.24-0.33 mg·kg-1by the fitting curve which involve the weight before pupation and the pupation rate， and it means that the appropriate level of selenium which added in the food of A. m. ligustica worker larvae is 0.32-0.36 mg·kg-1.

Apis mellifera ligustica； worker bee larvae； sodium selenite； appropriate level

2016-04-21；接受日期：2016-07-01

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-45）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目

聯(lián)系方式：蘇中渠，E-mail：15705484470@163.com。通信作者胥保華，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn