TSP-1和MMP-9在乳腺癌組織中的表達意義

傅芳萌， 黃建平， 黃　萌， 王　川

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TSP-1和MMP-9在乳腺癌組織中的表達意義

傅芳萌， 黃建平， 黃萌， 王川

目的探討乳腺癌組織中凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達及其與腫瘤微血管生成、患者預后的關系。方法采用免疫組織化學方法檢測131例乳腺癌患者組織中TSP-1、MMP-9的表達情況，比較研究指標的表達情況和腫瘤組織中微血管密度(MVD)及其與患者臨床病理特征、預后的關系。結果131例中，腫瘤間質中TSP-1的表達和腫瘤的MVD呈負相關(Spearman相關系數=-0.241,P=0.006)；腫瘤細胞中MMP-9與腫瘤間質中TSP-1共同高表達與乳腺癌組織大小、淋巴結轉移、病理分期密切相關(P<0.05)；生存分析發現二者共同高表達的患者相對于二者非共同高表達的患者預后不佳。結論乳腺癌組織中MMP-9聯合TSP-1共同高表達可作為評價乳腺癌預后有價值的標記物。

乳腺腫瘤； 凝血酶敏感蛋白1； 基質金屬蛋白酶9； 基質金屬蛋白酶類； 毛細血管； 預后

腫瘤微環境(tumor microenviroment)是由腫瘤細胞和腫瘤間質共同組成，二者相互作用，貫穿腫瘤發生發展的整個過程，并影響腫瘤細胞的生長、血管形成、轉移等多個病理生理過程。本研究中的2個分子分別為來源于腫瘤間質的凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin 1, TSP-1)和來源于腫瘤細胞的基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP-9)，其各自在乳腺癌中的表達以及對乳腺癌各種生物學行為的影響已有報道，但把這2個分子置于乳腺癌微環境中，對2種分子之間的相互作用、對腫瘤血管生成的影響，以及二者的表達狀態對乳腺癌生物學行為和預后影響的研究尚未見報道。筆者采用免疫組織化學檢測方法，評估131例乳腺癌患者的組織切片，以期判斷2種分子在乳腺癌中的表達情況，并探討其表達情況對乳腺癌患者預后的影響。

1　對象與方法

1.1對象收集2002年2月-2004年12月于筆者醫院行手術治療的女性乳腺癌患者131例，發病年齡(51.42±11.76)歲(24～92歲)，其中浸潤性導管癌99例，浸潤性小葉癌及其他類型的乳腺癌32例，具體臨床病理特征見表1。患者均經病理檢查證實為浸潤性乳腺癌，且術前均未進行任何的新輔助化療及內分泌治療等其他抗腫瘤治療，均行包含手術的綜合治療。

表1131例浸潤性乳腺癌患者的臨床病理參數概況

Tab 1The clinicopathological character of 131 breast cancer patients

臨床病理參數n(%)月經史　絕經前67(51．1)　絕經后64(48．9)病理類型　浸潤性導管癌99(75．6)　浸潤性小葉癌及其他類型32(24．4)腫瘤大小　T1+T2114(87．0)　T3+T417(23．0)淋巴結轉移　陰性72(55．0)　陽性59(45．0)病理分期　Ⅰ期31(23．7)　Ⅱ期67(51．1)　Ⅲ期33(25．2)組織學分級　Ⅰ級22(16．8)　Ⅱ級67(51．1)　Ⅲ級42(32．1)ER表達狀態　陰性50(38．2)　陽性81(61．8)PR表達狀態　陰性58(44．3)　陽性73(55．7)HER?2表達狀態　陰性103(78．6)　陽性28(21．4)

ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；HER-2：人表皮生長因子受體2.

1.2方法

1.2.1調閱檔案資料所有病例均重新在病案室和病理科調閱檔案資料，核對患者病案號、姓名、年齡、術前臨床檢查資料、術后病理資料、治療情況和預后信息，對部分術后病理信息不明確的患者均復審病理切片或取原有蠟塊重新切片檢測評估。

1.2.2免疫組織化學檢測組織標本經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規H-E染色。常規連續石蠟切片，厚約4 μm，本實驗中僅CD34抗原進行高溫高壓檸檬酸熱修復，TSP-1和MMP-9抗原不需進行抗原修復。抗體分別是羊抗人TSP-1多克隆一抗(N-20，美國Santa Cruz Biotecnology公司)，進行1∶400稀釋；鼠抗人MMP-9單克隆一抗工作液(56-2A4)，鼠抗人CD34單克隆一抗工作液(VG1)，均購自福州邁新生物技術有限公司，為即用型抗體。TSP-1抗原采用免疫組織化學SP法進行染色，MMP-9、CD34抗原采用MaxvisionTM法進行染色。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知骨髓巨核細胞TSP-1陽性標本作為TSP-1陽性對照，以已知乳腺癌MMP-9陽性標本作為MMP-9陽性對照。

1.2.3結果判定(1)TSP-1蛋白主要定位于間質細胞胞質，400倍光學顯微鏡下隨機選取10個熱點區域視野計算陽性細胞百分率并計分，參照文獻[1]將TSP-1蛋白表達分為2組，其中低表達組為TSP-1蛋白呈局灶陽性且<30%腫瘤間質著色；高表達組為超過30%腫瘤間質著色，即強陽性。(2)MMP-9蛋白主要定位于腫瘤細胞胞質，部分間質細胞亦可著色，采用半定量積分法判斷結果。400倍光學顯微鏡下隨機選取10個有代表性的視野計算陽性細胞百分率并計分，陽性細胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按細胞顯色強度計分：無顯色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項積分相乘，≥8分為高表達組，<8分為低表達。以CD34標記血管內皮細胞，平均微血管密度(microvescular density，MVD)根據文獻報道的方法進行計算[2]，所有患者平均MVD為(12.7±4.59)，以12.7為標志，將平均MVD分為高MVD組和低MVD組。

1.2.4隨訪通過電話及門診復查的方式對131例乳腺癌患者進行隨訪，隨訪截止時間為2010年12月31日。

1.3統計學處理將患者信息及實驗檢測結果用EXCEL軟件建立數據庫，運用SPSS 16.0軟件進行統計分析。TSP-1和MMP-9表達情況與乳腺癌臨床病理參數的相關性采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；兩個獨立變量間的相關性評估采用Spearman相關系數檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier曲線法，Log-rank檢驗單因素和多因素Cox回歸比例風險模型。所有統計檢驗均為雙側概率檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2　結　果

2.1免疫組織化學染色結果MMP-9蛋白陽性信號主要定位于乳腺癌癌細胞胞質中，腫瘤間質細胞亦有輕度表達，呈黃色或棕黃色。乳腺癌癌細胞多呈強陽性表達，常為片狀、灶狀散在分布，其MMP-9高表達約64.9%(85/131)，周圍正常乳腺組織小葉及導管上皮細胞中呈無表達或弱表達。TSP-1蛋白陽性信號主要定位于腫瘤間質中，特別是同癌巢鄰近的間質，主要表達于成纖維細胞、肌成纖維細胞、血管平滑肌細胞，血管周圍基底膜等，常呈片狀分布。TSP-1高表達率約52.3%(69/131)，部分乳腺癌細胞胞質呈輕度非特異性染色。2種蛋白共同高表達的患者50例(38.2%)。同一張乳腺癌切片的近同一個區域TSP-1、MMP-9及微血管的表達情況見圖1。

2.2各個指標與乳腺癌MVD及臨床病理特征的關系從表2可看出，腫瘤間質TSP-1的高表達同腫瘤MVD呈弱的負相關(Spearman相關系數為-0.241,P=0.006)，而腫瘤細胞MMP-9高表達、TSP-1和MMP-9的共表達與MVD無關(結果另文發表)。如表3所示，131例中，將MMP-9和TSP-1同時呈高表達的病例歸為共同高表達組，與其他病例組成的非共同高表達組進行比較，發現共同高表達組和更高的腫瘤大小分期(T3+T4)、腋窩淋巴結轉移以及更高的病理分期密切相關(χ2分別為8.700，5.488，8.615，而相應的P值達到0.003，0.019，0.013)，差別均具有統計學意義，而與腫瘤病理類型、組織學分級及雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)的表達狀態無關(P>0.05)，提示MMP-9和TSP-1共同高表達組的乳腺癌患者較其他病例組的患者具有更多不良的預后因素，可能與腫瘤的惡性生物學行為存在關系。

表2　乳腺癌組織TSP-1表達及其與MVD的相關性

TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MVD：微血管密度.

表3MMP-9和TSP-1共同表達同乳腺癌臨床病理參數的關系

Tab 3The relationship of Co-expression of MMP-9 and TSP-1 with clinicopathologic character of breast cancer

臨床病理參數n總MMP?9和TSP?1表達情況n非共同高表達n共同高表達月經狀態　絕經前644222　絕經后673928病理類型　浸潤性導管癌996237　其他類型321913腫瘤大小☆☆　T1+T21147638　T3+T417512淋巴結轉移☆　陰性725121　陽性593029病理分期☆　Ⅰ期31247　Ⅱ期674324　Ⅲ期331419組織分級　Ⅰ級+Ⅱ級895732　Ⅲ級422418ER狀態　陰性502921　陽性815229PR狀態　陰性583424　陽性性734726HER?2狀態　陰性1036637　陽性281513

TSP-1：凝血酶敏感蛋白1； MMP-9：基質金屬蛋白酶9； ER：雌激素受體； PR：孕激素受體； HER-2：人表皮生長因子受體2.☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.3MMP-9和TSP-1共同表達情況與乳腺癌預后的相關性如圖2所示，先采用Kaplan-meier曲線法和Log-rank檢驗對乳腺癌MMP-9、TSP-1二者共同高表達與乳腺癌無病生存率(disease-free survival, DFS)和總生存率(overall survival, OS)的關系進行分析，發現MMP-9、TSP-1共同高表達可以顯著降低DFS和OS,其5年DFS和OS分別為68.0%和74.0%，而MMP-9、TSP-1二者非共同高表達的患者，5年DFS和OS分別為87.2%與90.8%，差別均有統計學意義，提示這2個指標共同高表達可能預示患者預后不良。進入多因素Cox回歸風險比例模型進行分析后(表4，5)，除了腫瘤大小、組織學分級為影響患者DFS和OS的獨立預后因素之外，MMP-9、TSP-1共同過表達也成為影響DFS的獨立預后因子(P=0.028，危險比為2.288，95%CI為1.094～4.786)，但是對OS的影響接近有意義的統計學差異(危險比為2.169，95%CI為0.963～4.887)。

3　討　論

TSP-1是一種高分子量的糖蛋白，主要來源于腫瘤間質，是一種內源性血管生成抑制因子，在腫瘤微環境中廣泛與其他蛋白相互作用，從而影響活化的轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的水平。TSP-1還可以調節腫瘤間質的構成以及間質中MMP的活性[3]，這其中也包括了MMP-9，而且TSP-1表達還可以影響到腫瘤組織中MMP-9的表達量[4]，從而進一步影響腫瘤的侵襲轉移。此外疾病病程中，TSP-1和MMP-9亦可以參與病變組織中微血管生成，從而影響疾病的發展[5-6]。

筆者的研究發現，乳腺癌組織間質中TSP-1蛋白的表達同腫瘤間質中的MVD存在弱的負相關(Spearman相關系數為-0.241，P=0.006)，與Fontana等觀察到的結果一致[7]。而Rice等并未在乳腺導管原位癌病例中發現間質TSP-1的表達與MVD的高低存在著相關[8]，這與浸潤性乳腺癌和導管原位癌有著不同的腫瘤微環境相關，腫瘤發展的不同時期,血管的生成受微環境中多種促血管生成因子(如VEGF等)和抑制血管生成因子共同作用，因而筆者觀察到浸潤性乳腺癌間質TSP-1蛋白的表達確實同MVD存在著負相關，但是相關性很弱，與其他調節血管生長因子的作用影響相關。Naumov等發現，在腫瘤的早期階段，僅有一小部分腫瘤細胞具有促血管生成能力和發生轉移，此時間質成纖維細胞中增加TSP-1的表達，并發揮抑制血管生成和腫瘤生長的作用；以后隨著腫瘤的進展，延長TSP-1的作用時間，腫瘤細胞會發生轉變，增加VEGF和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等促血管生成因子的表達，并激活PI3K/MYC信號傳導途徑，此時高水平的VEGF可慢慢抑制TSP-1的作用，并促進血管生成，但何時發生轉變還不明確[9]。

表4　MMP-9、TSP-1共同高表達及臨床病理參數對乳腺癌患無病生存率影響的多因素Cox回歸風險比例模型

ER：雌激素受體；HER-2：人表皮生長因子受體2；TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MMP-9：基質金屬蛋白酶9.B：回歸系數；SE：標準誤；Wald：χ2統計量；df：自由度；Sig：顯著性檢驗值；Exp(B)：危險比；95%CI：95%可信區間.

本課題通過免疫組織化學檢測方法對腫瘤細胞MMP-9陽性表達和腫瘤間質中TSP-1高表達分別與乳腺癌的各種常見臨床參數進行分析，發現二者共同表達與腫瘤體積大(T3+T4)、腋窩淋巴結轉移、病理分期高均密切相關。隨后的生存分析發現，MMP-9、TSP-1陽性以及二者共同陽性表達病例相對于MMP-9、TSP-1陰性以及二者非共同陽性表達病例，其5年DFS及OS均顯著降低，經過多因素Cox回歸風險比例模型分析后，發現MMP-9、TSP-1共同陽性表達可顯著降低乳腺癌患者的5年DFS。

表5　MMP-9、TSP-1共同高表達及臨床病理參數對乳腺癌患者總生存率影響的多因素Cox回歸風險比例模型

ER：雌激素受體；HER-2：人表皮生長因子受體2；TSP-1：凝血酶敏感蛋白1；MMP-9：基質金屬蛋白酶9.B：回歸系數；SE：標準誤；Wald：χ2統計量；df：自由度；Sig：顯著性檢驗值；Exp(B)：危險比；95%CI：95%可信區間.

近年來不少文獻針對TSP-1和MMP-9表達同惡性腫瘤預后的關系進行了研究，結果并不完全一致，有的甚至相互矛盾。在TSP-1表達與腫瘤預后的研究中，部分腫瘤TSP-1的陽性表達同腫瘤的預后良好相關，例如胃癌、黏液表皮樣癌中TSP-1陽性表達提示著患者預后良好[10-11]，而在膀胱癌中卻是預后不良的指標[12]。此外Maeda等發現，在結直腸癌中，TSP-1陽性表達抑制腫瘤微血管形成，且陽性表達患者預后和肝轉移發生率優于陰性表達的患者，是一個預后良好的指標[13]；然而在結直腸癌肝轉移瘤中，TSP-1的表達卻是預后不良的標記[14]。這可能和TSP-1在不同腫瘤微環境中發揮的調節血管生長、腫瘤間質塑造等發揮的作用不同有關。

MMP-9高表達常出現在浸潤性癌癥中，并成為惡性腫瘤的一個獨立的預后因子。例如，在卵巢癌中，腫瘤細胞高表達MMP-9，其10年DFS也高[15]；但是在胃癌中，高表達MMP-9會降低患者與腫瘤相關的生存率[16]；食管癌中，MMP-9高表達常同腫瘤浸潤深度、淋巴管瘤栓、淋巴結轉移和腫瘤低分化密切相關[17]；而在前列腺癌中，MMP-9的高表達同腫瘤的高Gleason分級相關，同預后無關[18]。這些研究結果提示，TSP-1和MMP-9的陽性表達對惡性腫瘤的預后影響是依不同性質的腫瘤而改變的。

目前在通過免疫組織化學方法檢測MMP-9蛋白在乳腺癌細胞中的表達情況和乳腺癌患者的預后關系的研究中，大多認為，腫瘤細胞中MMP-9蛋白表達越高，患者復發轉移的可能性就越大，生存期越短。Giannelli和Zeng等學者通過免疫組織化學方法證實，高表達MMP-9的乳腺癌同腫瘤侵襲性強、預后不佳相關[19-20]。Puzovic等研究發現，乳腺癌細胞中，MMP-9、MMP-2和ETS-1共同高表達的患者是患者預后不良的一個獨立影響因子，而MMP-9蛋白的表達并不是一個獨立預后因子[21]。這個與筆者的研究結果類似，腫瘤細胞中MMP-9蛋白單一指標表達改變可能不足以影響患者的預后，聯合其他預后指標共同表達的情況可能可以更準確預測乳腺癌患者的預后。對乳腺癌的基因表達譜進行大規模分析后表明，MMP-9基因表達高低和乳腺癌侵襲性密切相關，是乳腺癌一個重要的預后指標[22]。

本研究結果表明，通過較為簡單的免疫組織化學檢測，分析乳腺癌間質中TSP-1的表達可以抑制腫瘤組織中微血管生成，此外腫瘤間質中TSP-1與腫瘤細胞中MMP-9的共同高表達與乳腺癌患者的不良預后密切相關，二者共同表達的情況可以作為判斷乳腺癌不良預后的指標之一。

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(編輯：何佳鳳)

Expression and Prognostic Significance of TSP-1 and MMP-9 in Breast Cancer

FU Fangmeng, HUANG Jianping, HUANG Meng, WANG Chuan

Department of Breast Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo investigate how the expression of Matrix metalloproteinases 9 (MMP-9) and Thrombospondin 1 (TSP-1) would be related to microvessel density (MVD) in breast cancer and its implication for the prognosis.MethodWith immunohistochemical staining method, the expression level of MMP-9 and TSP-1 were measured in tissues from 131 breast cancer patients.The relation between the two biomarkers and MVD and prognosis of breast cancer was analyzed.ResultsIn 131 breast cancer patients, expression of TSP-1 in stroma was negatively related to MVD (Spearman relation index=-0.241,P=0.006).The co-overexpression of MMP-9/TSP-1 was significantly related to tumor size, lymph node metastasis, and pathological stage(P<0.05).And survival analysis revealed that co-overexpression of MMP-9/TSP-1 was unfavorable prognostic factor in breast cancer.ConclusionMMP-9/TSP-1 co-overexpression was an independent unfavorable prognostic factor for breast cancer.

breast neoplasms; thrombospondin 1; matrix metalloproteinase 9; matrix metalloproteinases; capillaries; prognosis

2016-03-02

福建省衛生廳青年基金(2009-2-28)

福建醫科大學 附屬協和醫院乳腺外科，福州350001

傅芳萌(1978-)，男，副主任醫師，醫學博士

王川. Email:chuanwang68@qq.com

R345.63； R345.9； R730.7； R737.9； R977.6

A

1672-4194(2016)05-0295-07