CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在1型糖尿病中表達(dá)及功能分析

劉西鳳，王 勇，王芝濤，翟志敏

CD4+CD25+CD127low/-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在1型糖尿病中表達(dá)及功能分析

劉西鳳1，王 勇1，王芝濤1，翟志敏2

目的 檢測(cè)1型糖尿病（T1DM）患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的表達(dá)及功能變化，探討Tregs在1型糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 收集36例初診T1DM患者（T1DM組）和20例青年健康志愿者（對(duì)照組）外周血，留取血漿，密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。以CD4+CD25+CD127low/-作為T(mén)regs的分子標(biāo)記，分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR法及ELISA法檢測(cè)外周血中Tregs的比例、FoxP3 mRNA表達(dá)水平及血漿細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）濃度。采用CCK-8法檢測(cè)Tregs對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞（Teffs）的增殖抑制作用。結(jié)果 初診T1DM患者外周血Tregs比例、FoxP3 mRNA表達(dá)水平及血漿細(xì)胞因子IL-10濃度較對(duì)照組均顯著降低（P＜0.05）。T1DM患者外周血Tregs對(duì)Teffs的增殖抑制作用較對(duì)照組顯著減弱（P＜0.05）。結(jié)論 Tregs的表達(dá)和調(diào)控功能降低可能是T1DM發(fā)生和發(fā)展的重要原因。

1型糖尿病；調(diào)節(jié)性細(xì)胞；免疫耐受

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由自身T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化產(chǎn)生的一種以胰島β細(xì)胞進(jìn)行性免疫損傷為表現(xiàn)的自身免疫性疾病。在其發(fā)病過(guò)程中有多種免疫細(xì)胞參與，其中自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化起重要作用［1］。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群，于1995年Sakaguchi et al［2］在對(duì)小鼠自身免疫性疾病的研究中被首次發(fā)現(xiàn)。近年研究［3］顯示，Tregs在維持自身免疫耐受、避免自身免疫性疾病的發(fā)生中具有重要作用。該細(xì)胞亞群可以通過(guò)細(xì)胞間直接接觸或分泌抑制性細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）以及白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等，調(diào)控自身反應(yīng)性T細(xì)胞的過(guò)度活化，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。當(dāng)其數(shù)量降低或功能缺陷時(shí)，會(huì)誘發(fā)多種自身免疫性疾病［3］。該研究旨在通過(guò)檢測(cè)分析T1DM患者外周血Tregs的數(shù)量以及功能狀況，探討該細(xì)胞亞群在T1DM發(fā)生和發(fā)展中所起的作用，為該疾病的臨床診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選擇2014年12月～2015年8月于解放軍第105醫(yī)院初次診斷的36例T1DM患者（T1DM組），年齡12～36（22.25±6.64）歲；男20例，女16例；均符合1999年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：①空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/ L（126 mg/dl）；② 有糖尿病癥狀，并且任意時(shí)間血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L（200 mg/dl）；典型的糖尿病癥狀是多尿、多飲和難以解釋的體重減輕；③口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）2 h血漿葡萄糖（PG）≥11.1 mmol/L（200 mg/dl）。符合上述標(biāo)準(zhǔn)之一的患者，在次日復(fù)診仍符合3條標(biāo)準(zhǔn)之一者即診斷為糖尿病，且空腹C-肽＜0.4 nmol/L，谷氨酸脫羧酶抗體（GAD-Ab）陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：凡伴急慢性感染、腫瘤、嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、妊娠以及其他自身免疫性疾病者均予排除。對(duì)照組（healthy control，HC組）20例，均為解放軍第105醫(yī)院健康體檢中心志愿者，男10例，女10例；年齡14～33（21.45±6.94）歲，OGTT排除糖尿病，且無(wú)糖尿病家族史，無(wú)其他急、慢性疾病。兩組受檢者的性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究方案經(jīng)中國(guó)人民解放軍第105醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 外周血Tregs測(cè)定 抽取T1DM組患者和對(duì)照組志愿者靜脈血5 ml加入肝素抗凝管，2 000 r/ min離心15 min，留存血漿2 ml于-80℃冰箱中備用。離心后剩余細(xì)胞采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），并計(jì)細(xì)胞總數(shù)。取100 μl細(xì)胞懸液（1×106）加入CD4-PE、CD25-FITC、CD127-PC5單克隆抗體各20 μl，室溫避光孵育30 min后，洗滌2次，加入500 μl染色緩沖液混勻，使用流式細(xì)胞儀（FC500 MPL，美國(guó)Beckman Coulter公司）收集10 000個(gè)細(xì)胞/管，F(xiàn)lowjo軟件獲取數(shù)據(jù)，分析CD4+CD25+CD127low/-Tregs占CD4+細(xì)胞百分比。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)外周血 PBMCs中 FoxP3 mRNA表達(dá)水平 采用TRIzol試劑提取上述剩余外周血PBMCs中總mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入25 μl Real-time PCR反應(yīng)體系中。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；64℃退火45 s；72℃延伸60 s；40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線和溶解曲線判斷反應(yīng)質(zhì)量，采用2-ΔΔCt法計(jì)算T1DM組和對(duì)照組間FoxP3 mRNA的差異表達(dá)倍數(shù)，檢測(cè)FoxP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。人GAPDH作為管家基因，各引物序列見(jiàn)表1。

表1 人FoxP3和GAPDH引物序列

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 在分離T1DM組和對(duì)照組PBMCs同時(shí)，預(yù)留的血漿放置于-80℃冰箱中保存，集中待測(cè)。血漿細(xì)胞因子 IL-10、TGF-β檢測(cè)采用ELISA法，試劑盒購(gòu)于美國(guó) R&D公司，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 Tregs免疫抑制功能測(cè)定 因 CD4+CD25+CD127low/-Tregs僅占PBMCs約1%，難以獲取足夠數(shù)量的 Tregs。細(xì)胞功能測(cè)定中，以 CD4+CD25+Tregs為研究對(duì)象。選取3例初診T1DM患者和3例健康對(duì)照者，抽取15 ml靜脈血，密度梯度離心法分離PBMCs，經(jīng)CD4+CD25+Tregs細(xì)胞分離純化試劑盒（德國(guó)Mihenyi公司）分離，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，分離出CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞（Teffs）。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示細(xì)胞純度均在90%以上。

以10 mmol/L無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）將抗人CD3單克隆抗體稀釋成1 mg/L溶液，包被96孔微孔板，100 μl/孔4℃過(guò)夜，棄去反應(yīng)板內(nèi)液體，PBS洗板3次，每次3 min，備用。

將上述分離的Teffs與Tregs用PBS洗滌，Teffs單獨(dú)培養(yǎng)以及按照1∶1、1∶2、1∶4、0∶1的比例接種于抗CD3包被的96孔板中，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)至終體積為200 μl，細(xì)胞總數(shù)為1×105。再加入終濃度為1 mg/L的抗CD28抗體，每組設(shè)3孔。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)5 d，加入CCK-8溶液，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（optical delnsity，OD）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［100-（OD實(shí)驗(yàn)-OD本底）］/（OD對(duì)照-OD本底）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 外周血中Tregs定量檢測(cè)結(jié)果 T1DM患者和健康對(duì)照者外周血中CD4+T細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.16，P＞0.05）；而T1DM組患者CD4+CD25+CD127low/-Tregs所占CD4+T細(xì)胞百分比較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.81，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2T1DM組和對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞及Tregs百分比（%，）

表2T1DM組和對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞及Tregs百分比（%，）

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=20）T1DM組（n=36） t值 P值CD4+T細(xì)胞 35.97±1.21 37.71±0.84 1.16 0.252 Tregs 4.51±1.44 2.23±0.72-6.81 0.001

2.2 外周血中 Foxp3 mRNA定量檢測(cè)結(jié)果Foxp3作為T(mén)regs特異性的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于Tregs分化發(fā)育及發(fā)揮功能具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，T1DM組患者外周血中Foxp3 mRNA表達(dá)水平為（0.61± 0.07），與對(duì)照組（0.99±0.08）比較顯著降低（t=-18.68，P＜0.01）。

2.3 外周血中IL-10、TGF-β濃度定量檢測(cè)結(jié)果T1DM組患者血漿IL-10濃度為（1.17±0.13）ng/ ml，對(duì)照組為（1.87±0.72）ng/ml；與對(duì)照組比較，T1DM組患者 IL-10濃度顯著降低（t=13.67，P＜0.01）。T1DM組患者血漿TGF-β濃度為（13.76± 3.47）ng/ml，對(duì)照組為（16.86±7.35）ng/ml。T1DM組患者血漿中TGF-β濃度雖有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 T1DM患者外周血中Tregs免疫抑制功能分析 T1DM組患者Teffs與Tregs按照1∶1、1∶2、1∶4、0∶1的比例培養(yǎng)的平均抑制率分別為（50.2± 4.3）%、（26.4±3.6）%、（17.5±5.3）%、0%；對(duì)照組的平均抑制率分別為（68.5±3.9）%、（46.3± 5.1）%、（28.6±4.5）%、0%。T1DM組與對(duì)照組相比平均抑制率均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.147，P＜0.05）。

3 討論

T1DM的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，涉及遺傳、免疫、年齡等多種因素，但普遍認(rèn)為T(mén)effs/Tregs細(xì)胞功能失衡可能在1型糖尿病的發(fā)病過(guò)程中起較為關(guān)鍵的作用。Teffs主要功能為增加胰腺免疫反應(yīng)，介導(dǎo)對(duì)β細(xì)胞的破壞而致1型糖尿病的發(fā)生；而Tregs則發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)胰島細(xì)胞的作用。既往研究［4］表明，Tregs過(guò)度累積、功能亢進(jìn)會(huì)導(dǎo)致宿主產(chǎn)生惡性腫瘤等疾病的風(fēng)險(xiǎn)大大增加；而Tregs數(shù)量降低及功能缺陷又會(huì)誘發(fā)多種自身免疫性疾病。

研究［5-7］顯示，在Graves病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病患者外周血中，Tregs數(shù)量較對(duì)照組明顯降低。與先前Michalek et al［8］結(jié)果類似，本研究顯示，T1DM患者外周血Tregs的數(shù)量顯著降低，導(dǎo)致Tregs對(duì)Teffs抑制功能不足，持續(xù)激活患者體內(nèi)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，進(jìn)而無(wú)法保護(hù)正常胰島細(xì)胞受到免疫攻擊，可能是1型糖尿病發(fā)病的一種起始因素。最近一項(xiàng)研究［9］指出，1型糖尿病患者接受直接輸注Tregs的干預(yù)后，其C肽水平升高，胰島細(xì)胞功能得到改善。

一直以來(lái)，F(xiàn)oxP3是較公認(rèn)的Tregs的特異性標(biāo)志，也是Tregs發(fā)育過(guò)程中必不可少的調(diào)控基因［10］。但是由于FoxP3在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，只有破膜后才得以測(cè)定。而且，CD127與FoxP3相關(guān)性良好，也是反映Tregs比較理想的分子標(biāo)記［11］。因此本研究中采用CD4+CD25+CD127low/-作為T(mén)regs的免疫標(biāo)記。

研究［12］表明，在多種自身免疫性疾病患者中均發(fā)現(xiàn)Tregs表達(dá)FoxP3 mRNA水平減少，可能導(dǎo)致在一定程度上對(duì)于自身反應(yīng)性T細(xì)胞抑制能力降低，不足以維持自身免疫耐受，是自身免疫性疾病發(fā)病的重要因素。另有研究［13］顯示，NOD鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β使Foxp3 mRNA水平高表達(dá)后，胰島內(nèi)Tregs數(shù)目增多，糖尿病的發(fā)生延遲。本研究中，T1DM患者外周血FoxP3 mRNA水平較對(duì)照組顯著降低，可能是1型糖尿病發(fā)病的重要原因之一。

Tregs可以通過(guò)產(chǎn)生具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，抑制Teffs過(guò)度活化，其中IL-10占主要作用［14］。IL-10作為一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)控作用，主要抑制Teffs的增殖和抑制Teffs產(chǎn)生細(xì)胞因子如IL-2等。已有研究［15］證實(shí)，用IL-10干預(yù)NOD鼠，IL-10可上調(diào)Tregs水平，減少糖尿病的發(fā)生。本研究中，T1DM組患者細(xì)胞因子IL-10水平顯著降低，從另一方面也反映了T1DM組患者Tregs存在數(shù)量降低或者功能缺陷。此外，T1DM組患者細(xì)胞因子TGF-β水平較對(duì)照組有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與本研究中樣本量偏少有關(guān)，并有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

Tregs不僅數(shù)量上降低會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，其功能上的缺陷亦是不可忽略的重要因素［16］。Ferreira et al［17］發(fā)現(xiàn)，在 NOD鼠體內(nèi)存在Tregs數(shù)量減少，且在發(fā)生自身免疫糖尿病之前，就已出現(xiàn)Tregs功能異常，表現(xiàn)為體外不能抑制多克隆活化的CD25+細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中，T1DM患者外周血Tregs抑制功能較對(duì)照組存在明顯缺陷，Teffs的增殖活化能力增強(qiáng)，可能是T1DM發(fā)病的重要因素之一。

綜上所述，初診T1DM患者外周血Tregs不僅數(shù)量明顯降低，其對(duì)Teffs的抑制作用亦存在明顯缺陷。此外，T1DM患者外周血IL-10濃度和FoxP3 mRNA水平降低從另一方面也反映T1DM患者Tregs存在數(shù)量降低和功能缺陷。深入研究T1DM患者Tregs表達(dá)及功能狀況，有可能為研究T1DM的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

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Quantitation and functional analysis of CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells in patients with type 1 diabetes mellitus

Liu Xifeng，Wang Yong，Wang Zhitao，et al
（Dept of Endocrinology，The 105th Hospital of PLA，Hefei 230031）

Objective To investigate the role of regulatory T cells（Tregs）in type 1 diabetes mellitus（T1DM）. Methods 36 newly diagnosed T1DM patients and 20 healthy controls were involved in this study.Plasma was collected，then density gradient centrifugation was used for separation of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）. CD4+CD25+CD127low/-was used as molecular marker for Tregs.Flow cytometry（FCM），RT-PCR and ELISA were used for detecting the Tregs frequency，F(xiàn)oxP3 mRNA expression and concentrations of plasma cytokines IL-10 and TGF-β.The inhibitory effect of Tregs on T effector cells（Teffs）was assayed by CCK-8 proliferation experiment.Results The expression of Tregs，F(xiàn)oxP3 mRNA expression and concentration of plasma cytokine IL-10 were significantly decreased in comparison with that in the healthy controls（P＜0.05）.The inhibitory function of Tregs from T1DM patients was decreased significantly compared with the healthy controls（P＜0.05）.Conclusion The decrease quantitation and function of Tregs may play an important role in the occurrence and development of type 1 diabetes mellitus.

type 1 diabetes mellitus；regulatory T cells；immune tolerance

R 587.1

A

1000-1492（2016）09-1316-04

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.036.html

2016-05-04接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81141104）

1解放軍第105醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 2300312安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

劉西鳳，女，主治醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：woaiwojia0506@ 126.com