二甲雙胍對2型糖尿病模型大鼠TNF-α表達的影響

李業瓊，葉山東，翟麗敏，胡 聞

二甲雙胍對2型糖尿病模型大鼠TNF-α表達的影響

李業瓊1，葉山東1，翟麗敏1，胡 聞2

目的 觀察不同劑量二甲雙胍對2型糖尿?。═2DM）模型大鼠腎組織及血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響，探討二甲雙胍對糖尿病腎病的保護機制。方法 從53只SD大鼠中隨機選取8只作為正常對照組（NC組），其余大鼠給予高脂飼料喂養結合鏈脲佐菌素（STZ）腹腔小劑量注射，建立T2DM大鼠模型。模型大鼠隨機分組，分別為糖尿病模型組（T2DM組）；二甲雙胍干預治療組：M1組［150 mg/（kg·d）］、M2組［300 mg/（kg·d）］、M3組［500 mg/（kg·d）］；格列本脲組［GLY，5 mg/（kg·d）］。干預組給藥8周后，觀察各組大鼠血糖（BG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、尿素氮（BUN）、尿白蛋白肌酐比（UACR）；采用免疫組化法檢測腎小球TNF-α蛋白表達，ELISA法檢測血清中TNF-α的水平。結果 各劑量二甲雙胍及GLY干預組BG、HbA1c、UACR和BUN明顯低于T2DM組，但高于NC組（P＜0.05），且M2、M3組低于M1組（P＜0.05）；GLY組與各劑量二甲雙胍組BG、HbA1c水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；GLY與M2、M3組UACR、BUN水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。各劑量二甲雙胍及GLY干預組血清TNF-α表達水平較T2DM組明顯降低（P＜0.05），但高于NC組（P＜0.05），M3組低于M1組（P＜0.05）；GLY與M2、M3組差異有統計學意義（P＜0.05）。二甲雙胍干預組腎臟TNF-α蛋白的含量明顯下降，但高于NC組，且各干預組之間差異有統計學意義（P＜0.05）；GLY與M2、M3組差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 二甲雙胍可減輕T2DM大鼠腎組織TNF-α的表達及血清中TNF-α的含量，并呈一定的劑量依賴性，可能與二甲雙胍的腎臟保護作用有關。

2型糖尿??；糖尿病腎??；二甲雙胍；TNF-α

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發癥之一，也是糖尿病死亡的主要原因，其基本病理改變為系膜細胞增生和細胞外基質增多、腎小球基底膜增厚與腎小球硬化。二甲雙胍作為治療2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）的一線首選藥物［1］，近年來一些研究［2-3］顯示其在降低血糖的同時具有抗炎作用且對糖尿病慢性并發癥有一定益處，但具體機制尚不明確。該研究觀察二甲雙胍對T2DM大鼠腎組織腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達及血清TNF-α水平的影響，初步探討二甲雙胍對T2DM模型大鼠腎臟的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與主要儀器 二甲雙胍（上海施貴寶公司，批號：H20023370）；格列本脲（glyburide，GLY）（天津太平洋公司，批號：H12020790）；白蛋白放射免疫試劑盒（天津市協和公司）；尿肌酐（urine creatinine，Ucr）（苦味酸法）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）（脲酶法）試劑（南京建成科技公司）；胰島素放射免疫試劑盒（北京原子高科公司）；TNF-α免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；血清TNF-α ELISA試劑盒（上海艾來薩生物科技公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司）。DG-3022A型酶聯免疫檢測儀（江蘇南京國營華東電子管廠）；DS-5型糖化血紅蛋白檢測儀（英國DREW公司）；DFM-96型10管放射免疫計數儀（安徽合肥眾成機電公司）。

1.1.2 實驗動物 健康清潔級SD大鼠53只，雄性，180～200 g，2月齡，購自安徽醫科大學實驗動物中心。在飼養期間，12 h周期規律，相對濕度48%，室溫（19±1）℃，大鼠自由飲水，攝食。

1.2 方法

1.2.1 T2DM大鼠模型的制備 健康雄性SD大鼠53只隨機分成兩組：正常對照組（NC組，n=8）大鼠正常飼養；模型組（T2DM組，n=45）大鼠高脂飲食（常規飼料加10%豬油、2%膽固醇）。模型組給予高脂飲食4周后，經尾靜脈采血測血漿胰島素水平（fasting insulin，FINS）及空腹血糖（fasting peripheral blood glucose，FBG），并且計算胰島素抵抗指數（ho-

1.2.2 動物分組及給藥方法 去除造模失敗和死亡的大鼠，將剩余42只大鼠隨機分為五組：T2DM 組9只；低劑量二甲雙胍組9只［M1，150 mg/（kg· d）］；中等劑量二甲雙胍組8只［M2，300 mg/（kg· d）］；高劑量二甲雙胍組8只［M3，500 mg/（kg· d）］大鼠；GLY組8只［5 mg/（kg·d）］，于每日清晨灌胃，共8周。T2DM組及NC組給予等量的生理鹽水。二甲雙胍干預治療后8周末，最終各組大鼠分別為：T2DM組8只；M1組9只；M2組8只；M3 組8只；GLY組8只。

1.2.3 實驗指標觀察 以代謝籠收集12 h尿液并且準確計量，混合均勻后留取尿液5 ml，置于-40℃冰箱凍存，測尿蛋白（urinary albumin，UAlb）、Ucr含量。尿標本收集后，進行腹腔注射麻醉（10%的水合氯醛）后，經腹主動脈采血，測血糖（blood glucose，BG）、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）、BUN和血清TNF-α。摘取雙側腎臟經生理鹽水反復灌洗去除被膜，左腎組織置于液氮凍存；右腎制作石蠟切片，用來觀察腎組織的病理改變。

1.3 各指標檢測及方法

1.3.1 腎組織TNF-α的表達 載玻片防脫片處理；石蠟切片脫蠟水化；微波抗原修復；滅活內源性酶，滴加封閉液；滴加經稀釋的一抗（兔IgG 1∶200），4℃過夜，PBS洗2 min，共3次；再滴加聚合HRP標記抗兔IgG（SV-0002）二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片，觀察。于400倍下，每張切片取3個視野進行拍照，圖像中的陽性反應部位的累積光密度（integral optegral density，IOD）用全自動圖像分析系統（Image pro plus 6.0）測定，得出每張切片陽性物質的相對含量，用TNF-α IOD表示。

1.3.2 生化指標的檢測 血清TNF-α采用 ELISA法檢測；BUN采用尿酶法檢測；UAlb采用放射免疫分析法檢測；Ucr采用苦味酸比色法檢測。UAlb尿白蛋白排泄采用其與Ucr的比值表示，簡稱尿白蛋白肌酐比（urinary albumin/urine creatinine，UACR）。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行分析，數據用表示，多組間比較采用方差分析，方差齊采用SNK檢驗進行兩兩比較；方差不齊者用Dunnett's T3檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠一般生化指標比較 8周末，各T2DM組大鼠與NC組比較，BG、HbA1c、BUN及UACR水平明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；各劑量二甲雙胍及GLY干預組與T2DM組比較，上述指標明顯降低（P＜0.05）；M1、M2、M3三組間BG、HbA1c、BUN和UACR水平差異有統計學意義（P＜0.05）；GLY組與各劑量二甲雙胍組BG、HbA1c差異無統計學意義；GLY組與M2、M3組UACR、BUN差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠血清TNF-α比較 8周末，各T2DM組大鼠與NC組比較，血清TNF-α水平明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；各劑量二甲雙胍及GLY干預組與T2DM組比較，血清TNF-α顯著降低（P＜0.05）；M3組低于M1組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但M2與M1、M3兩組間血清TNF-α水平差異無統計學意義；GLY組與M2、M3組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠腎組織TNF-α蛋白表達的變化 8周末，T2DM組、各二甲雙胍組及GLY組腎組織TNF-α IOD相對表達量均較NC組增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；各二甲雙胍組及GLY組與T2DM組比較，腎組織TNF-α IOD水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；且M1、M2、M3三組之間差異有統計學意義（P＜0.05），GLY與M2、M3組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

表1 8周末各組大鼠生化指標比較（）

與NC組比較：*P＜0.05；與T2DM組比較：#P＜0.05；與M1組比較：△P＜0.05；與M2組比較：▽P＜0.05

項目 n BG（mmol/L） FINS（mU/L） HbA1c（%） BUN（mmol/L） UACR（mg/g）NC組 8 4.45±1.07 17.53±3.42 4.13±0.89 6.91±2.52 0.25±0.66 T2DM組 8 15.60±1.56* 28.16±4.98* 12.41±0.61* 18.95±0.98* 2.86±0.10*M1組 9 14.44±0.70* 25.24±3.80* 11.57±0.38* 13.23±2.20*# 2.39±0.17*#M2組 8 11.75±0.98*# 22.08±2.61*# 8.78±0.32*#△ 11.30±2.02*#△ 1.80±0.08*#△M3組 8 10.58±1.03*#△ 21.55±2.29*# 8.24±0.33*#△ 10.27±1.15*#△ 1.37±0.17*#△▽GLY組 8 11.78±1.43*# 22.89±0.15*# 8.85±1.07*#△ 14.03±2.55*#△▽ 2.37±0.12*#△▽F值 76.49 6.25 153.91 24.55 278.69

圖1 各組大鼠腎組織TNF-α的表達 ×400

表2 8周末各組大鼠血清及腎組織TNF-α含量比較（）

表2 8周末各組大鼠血清及腎組織TNF-α含量比較（）

與NC組比較：*P＜0.05；與T2DM組比較：#P＜0.05；與M1組比較：△P＜0.05；與M2組比較：▽P＜0.05

項目 n 血清TNF-α（pg/ml） 腎組織TNF-α IOD NC組 8 76.44±8.10 8.17±3.08 T2DM組 8 262.56±15.90* 61.32±6.22*M1組 9 177.99±28.48*# 33.48±6.76*#M2組 8 161.41±22.00*# 21.05±6.87*#△M3組 8 126.28±9.54*#△ 13.14±2.58*#△▽GLY組 8 211.48±22.85*#▽ 36.75±12.09*#▽F值 71.96 78.59

3 討論

TNF-α是一種主要由單核巨噬細胞等分泌產生的細胞因子，是機體炎癥反應的重要調節因子，也是DN病情進展的強預測因子之一［4-5］。TNF-α是在糖尿病患者中最早升高的炎性因子，且在DN過程中起到關鍵作用［6］。研究［7］顯示持續高血糖能刺激腎小球系膜細胞TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子合成，導致腎慢性炎癥。Navarro et al［8］報道在T2DM患者腎小球微血管病變的初期血清及尿液TNF-α水平已明顯升高，提示TNF-α過度表達參與了腎小球病變的發生并促進尿UAlb的產生。本研究結果顯示正常組大鼠腎組織和血清中TNF-α有低度表達，而T2DM組大鼠腎組織和血清TNF-α表達明顯上調，進一步證實高糖狀態下糖尿病大鼠體內和腎組織局部TNF-α表達增強。

二甲雙胍作為T2DM的首選抗糖尿病藥物［9］，近來一些研究［3］指出其對糖尿病腎臟損害尚有一定的保護作用，部分可能與其減輕體內TNF-α表達有關。Hyun et al［10］報道二甲雙胍能降低巨噬細胞TNF-α的分泌。本動物實驗結果顯示：經不同劑量二甲雙胍和GLY干預8周后，干預組BG、HbA1c、BUN及UACR水平明顯低于T2DM組，兩干預組BG和HbA1c水平無明顯差異，但二甲雙胍干預組UACR及BUN水平明顯低于GLY組，提示二甲雙胍在相似降血糖的情況下其腎臟保護作用優于GLY。提示二甲雙胍在降糖同時對腎臟存在一定的保護作用。進一步觀察顯示二甲雙胍及GLY組糖尿病大鼠血清TNF-α及腎組織TNF-α蛋白表達水平明顯下調，呈一定的劑量依賴性，且二甲雙胍的作用優于GLY，提示二甲雙胍在相似降血糖的情況下可更好地降低糖尿病大鼠體內和腎組織局部TNF-α表達，進而減輕腎臟損害。二甲雙胍降低糖尿病腎組織TNF-α表達的機制尚不明確。范梅琳 等［3］研究顯示二甲雙胍在體外可劑量依賴性地降低THP-1細胞相關炎癥因子如TNF-α的分泌，提示其具有一定的直接抗炎作用，而并非完全依賴控制血糖。有研究者指出二甲雙胍可劑量依賴地激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）［11-12］，進而抑制NF-κB抑制因子（inhibitory NF-κB，IκB）激酶的活性，降低IκB的磷酸化和降解，從而降低 TNF-α以及 NF-κB的激活［1］。Alhaider et al［13］在轉錄水平證實二甲雙胍可顯著恢復氧化應激相關基因mRNA的表達，并抑制TNF-α和IL-6等促炎基因的表達和分泌，對糖尿病大鼠腎臟發揮保護作用。

綜上所述，本實驗初步結果顯示二甲雙胍可降低糖尿病大鼠腎組織TNF-α蛋白的表達和降低血清TNF-α的水平，并且呈一定的劑量依賴性，該作用可能與其腎臟保護部分有關，具體機制還有待進一步研究。

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Effects of metformin on expression of renal tissue and serum level of TNF-α in type 2 diabetic rats

Li Yeqiong，Ye Shandong，Zhai Limin，et al
（Dept of Endocrinology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To observe the effects of different doses of metformin on the expression of renal tissue tumor necrosis factor-α（TNF-α）and serum levels of TNF-α in Type 2 diabetes（T2DM）model rats and discuss the mechanism of the metformin in the protection against diabetic renal injury.Methods 8 rats were randomly selected in 53 SD rats as the normal control group（NC）.The remaining rats were fed with high fat-diet and intraperitoneal injection of low dose of streptozotocin（STZ）to establish the model rats of T2DM.All model rats were randomly divided into T2DM model group（group T2DM），metformin groups［M1，150 mg/（kg·d）；M2，300 mg/（kg·d）；M3，500 mg/（kg·d）］and glyburide group［GLY，5mg/（kg·d）］.The rats of metformin and GLY groups continuously received treatment fro eight weeks.After 8 weeks，blood glucose（BG），glycated hemoglobin（HbA1c），BUN and urinary albumin/urine creatinine（UACR）were detected.The expression of renal tissue TNF-α was detected by using immunohistochemistry assay.The levels of serum TNF-α was tested by ELISA.Results The levels of BG，HbA1c，UACR and BUN in Metformin and GLY groups were significantly decreased than those of T2DM group，while higher than those of NC group（P＜0.05）.The levels of BG and HbA1c were not statistically significant between GLY and MET groups；the levels of UACR and BUN in Metformin groups were significantly lower than GLY group.The levels of serum TNF-α in Metformin and GLY groups were significantly decreased compared with that of T2DM group（P＜0.05），but higher than that of NC group（P＜0.05），which in M3 were lower than that in M1 group（P＜0.05），the levels of serum TNF-α in MET groups were significantly lower than GLY group（P＜0.05）.The expression of renal tissue TNF-α protein was significantly decreased compared with that of T2DM group，which also had significant differences among different doses of metformin groups（P＜0.05），and the expression of renal tissue TNF-α protein in MET groups was significantly lower than GLY group（P＜0.05）.Conclusion Metformin can suppress the expression of renal tissue TNF-α and reduce the serum TNF-α level of type 2 diabetic rats with a dose-dependent manner，which may partly contribute to its reno-protection.

type 2 diabetes；diabetic nephropathy；metformin；TNF-α

R 977.15；R 587.24

A

1000-1492（2016）09-1312-04

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.034.htmlmeostasis model assessment-insulin resistance，HOMAIR）［HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5］。給予30 mg/ kg的STZ（溶解于現配的0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液中，pH 4.4）腹腔注射，正常對照組大鼠注射等量枸櫞酸緩沖液。穩定72 h后測隨機血糖≥16.7 mmol/L，且伴胰島素抵抗者為2型糖尿病模型成功大鼠。

2016-05-04接收

安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2011A157）；安徽省自然科學基金（編號：1508085SMH227）

安徽醫科大學附屬省立醫院1內分泌科、2病理科，合肥

230001

李業瓊，女，碩士研究生；葉山東，男，主任醫師，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：ysd196406@163.com