金絲桃苷抗小鼠腦缺血再灌注損傷的硫化氫機制

高珊珊，陳 碩，陳志武

金絲桃苷抗小鼠腦缺血再灌注損傷的硫化氫機制

高珊珊1，陳 碩2，陳志武1

目的 研究硫化氫（H2S）在金絲桃苷（Hyp）抗小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。方法 建立胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）基因敲除（CSE-/-）小鼠及其同窩野生對照（CSE+/+）小鼠腦缺血再灌注模型，CSE為內源性H2S合成酶；用小鼠跳臺實驗和水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶功能；檢測小鼠腦組織乳酸脫氫酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量。結果 腦缺血再灌注后，CSE-/-小鼠學習記憶功能的下降、腦組織LDH活性的下降、MDA含量的升高均較CSE+/+小鼠更明顯，Hyp（50、100 mg/kg）能改善由于腦缺血再灌注導致的CSE+/+小鼠以上指標的變化，但對CSE-/-小鼠無改善作用。結論 內源性H2S的缺失會加重小鼠腦缺血再灌注損傷；Hyp對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與CSE-H2S通路有關。

金絲桃苷；硫化氫；基因敲除；腦缺血再灌注損傷

缺血性腦血管疾病是臨床上的常見病多發病，嚴重危害人類健康和影響社會發展，其發生發展的病理生理機制尚不十分清楚，臨床治療效果較差，因此，研究腦缺血性損傷的病理機制是目前研究的熱點之一。金絲桃苷（hyperin，Hyp）屬黃酮醇苷化合物，結構為槲皮素-3-半乳糖苷，廣泛存在于杜鵑花科、藤黃科、豆科等多種植物中，研究［1］顯示Hyp對心肌缺血損傷、缺血性腦損傷等具有保護作用，但其保護機制尚不明確。前期研究［2］顯示Hyp具有腦血管舒張作用，且其舒張機制與內源性硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）有關，與此同時，外源性H2S供體NaHS也能夠舒張大鼠腦血管，且具有明顯的抗腦缺血損傷作用［3-4］。該實驗通過建立內源性H2S合成酶胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）基因敲除（CSE knockout，CSE-/-）小鼠及同窩野生對照（CSE+/+）小鼠腦缺血再灌注模型研究Hyp抗腦缺血再灌注損傷的作用與H2S的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Hyp（安徽醫學研究所）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.2 實驗儀器 FAl004型電子天平（上海天平儀器廠）；液氮罐（四川西亞機械有限公司）；全自動酶標儀（美國BIO-RAD公司）；超速冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；小鼠跳臺儀（成都泰盟科技有限公司）；Morris水迷宮系統（上海吉量軟件科技有限公司）。

1.1.3 動物 C57BL/6J小鼠：CSE-/-和 CSE+/+小鼠，10～16周，（22±3.0）g，基因型鑒定由上海南方模式生物科技發展有限公司完成，飼養于安徽醫科大學實驗動物中心，飼養溫度：（22±3）℃。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 CSE-/-和 CSE+/+小鼠雌雄各半，分別隨機分為5組：假手術組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（Model組）、Hyp（25、50、100 mg/kg組）組。灌胃給藥，Model組和Sham組灌胃給以等量生理鹽水。連續灌胃3 d，第3天灌胃1 h后開始造模。

1.2.2 腦缺血再灌注模型 術前12 h禁食、4 h禁水，3.5%水合氯醛（0.1 ml/10 g）麻醉后，仰臥固定，剔除頸正中部毛發，碘酒涂抹消毒，頸部正中切口，鈍性分離暴露雙側頸總動脈，小心分離兩側迷走神經并穿線，小鼠清醒后結扎雙側頸總動脈造成腦部缺血，20 min后松開拉線恢復腦血液灌流，Sham組僅分離雙側頸總動脈但不結扎，仔細縫合，術后注意保溫，常規飼養，術后12 h進行跳臺實驗。

1.2.3 跳臺實驗 按文獻［5］方法將小鼠放入跳臺儀中，適應5 min后，給鐵柵上通以36 V交流電刺激小鼠，記錄小鼠受電刺激后跳上平臺的時間作為學習的潛伏期，并記錄通電5 min內小鼠受到的電擊次數作為學習錯誤次數，以這兩項指標評價小鼠學習功能。24 h后，將小鼠置于平臺上，底部鐵柵通以36 V交流電，記錄小鼠跳至鐵柵受到電刺激的時間作為記憶潛伏期，若5 min內小鼠未跳下平臺，潛伏期按300 s計算，并以5 min內受到電擊次數作為記憶錯誤次數，以這二項指標來評價小鼠記憶功能。小鼠跳臺實驗結束后，斷頭取腦，腦組織保存于液氮中用于檢測腦組織LDH活性和MDA含量。

1.2.4 水迷宮實驗［6-7］圓形恒溫水池，水溫保持在（22±1）℃，按東南西北4個方向將水池平均劃分為4個象限（NE、SE、SW、NW），因水池內壁均為黑色，而本實驗所用C57BL/6J小鼠也為黑色，為使水迷宮視頻采集系統能準確跟蹤小鼠位置，實驗前在池中加入適量食用色素二氧化鈦粉末，將池水染為乳白色，平臺位于水面下1 cm，使肉眼無法看到平臺位置。正式實驗時將平臺固定在SW象限。按1.2.2所述方法造模，實驗分組同小鼠跳臺實驗，造模后第3天（即正式實驗前1 d）讓小鼠自由游泳1 min（不放置平臺）。

1.2.4.1 定位航行實驗 歷時4 d，每日每只小鼠測試4次，第1次和第4次從目標象限（SW）和其對側的象限（NE）入水，第2次和第3次采用隨機法確定入水象限（SE和NW象限），為避免小鼠按向左或向右的方向去定位，同一次測試中所有動物的入水點相同且入水方向均為面朝水池壁。監測時間為60 s，將小鼠入水至尋臺成功的時間記作逃避潛伏期，若小鼠在平臺上停留超過2 s則判斷為尋臺成功，實驗終止；若小鼠60 s內未找到平臺則潛伏期記為60 s，并將小鼠引導至平臺停留15 s。

1.2.4.2 空間搜索實驗 定位航行實驗結束后開始空間探索實驗，即實驗第5天，撤去SW象限的平臺，將小鼠由NE象限入水，記錄小鼠在60 s內穿過原平臺所在位置的次數、原平臺所在象限的游程比率以及時間比率（即動物在原平臺所在象限的游程和時間占總游程和總時間的比率），評價空間記憶能力。

1.2.5 腦組織LDH活力和MDA含量檢測 各組小鼠腦組織低溫下制成勻漿，離心后取上清液，將上清液分裝，一部分用于LDH活力檢測，另一部分用于MDA含量檢測。考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，嚴格按照LDH及MDA測定試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定吸光度，計算各組LDH活性及MDA含量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，實驗結果采用表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組之間比較時采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 CSE基因敲除對Hyp促進小鼠學習記憶功能的影響（跳臺實驗） 在CSE+/+小鼠中，與CSE+/+Sham組比較，CSE+/+Model組學習潛伏期延長，記憶潛伏期縮短，學習與記憶錯誤次數均增多，差異均有統計學意義（F=5.7、3.4、5.1、3.4，P＜0.01）；與CSE+/+Model組比較，Hyp 50 mg/kg能縮短腦缺血再灌注后CSE+/+小鼠學習潛伏期，減少學習錯誤次數（F=5.7、5.1，P＜0.05），Hyp 100 mg/kg能縮短CSE+/+小鼠學習潛伏期，延長記憶潛伏期，減少學習和記憶錯誤次數（F=5.7、3.4、5.1、3.4，P＜0.05，P＜0.01）。在CSE-/-小鼠中，與CSE-/-Sham組比較，CSE-/-Model組學習潛伏期延長，記憶潛伏期縮短，學習與記憶錯誤次數均增多，差異均有統計學意義（F=4.1、23.5、7.5、9.1，P＜0.01）；與CSE+/+Model組比較，CSE-/-Model組小鼠以上指標改變更為顯著（t=-3.0、2.4、-2.3、-4.7，P＜0.01）；Hyp對腦缺血再灌注后的CSE-/-小鼠的以上指標無明顯改善作用，與CSE-/-Model組比較差異無統計學意義。見表1。

2.2 CSE基因敲除對Hyp促進小鼠學習記憶功能的影響（水迷宮實驗） 在水迷宮定位航行實驗的第3、4天：在CSE+/+小鼠中，CSE+/+Model組的逃避潛伏期與CSE+/+Sham組比較均延長，差異有統計學意義（F=4.7、19.7，P＜0.01）；在CSE-/-小鼠中，CSE-/-Model組的逃避潛伏期與CSE-/-Sham組相比也均延長（F=8.6、6.0，P＜0.01），且CSE-/-Model組第3、4天逃避潛伏期延長較CSE+/+Model組更顯著，差異有統計學意義（t=-2.6、-3.2，P＜0.05，P＜0.01），見圖 1C；Hyp 50、100 mg/kg能夠縮短CSE+/+腦缺血再灌注小鼠第3、4天的逃避潛伏期，與CSE+/+Model組比較差異有統計學意義（F=4.7、19.7，P＜0.05，P＜0.01），見圖1A；Hyp對腦缺血再灌注后的CSE-/-小鼠逃避潛伏期無縮短作用，與CSE-/-Model組比較差異無統計學意義，見圖1B。

水迷宮空間探索實驗結果見表2，CSE+/+小鼠中，與CSE+/+Sham組比較CSE+/+Model小鼠的穿過原平臺次數、原平臺象限時間比率及原平臺象限游程比率均顯著減少，差異有統計學意義（F=6.0、10.0、11.78，P＜0.01）；在 CSE-/-小鼠中，CSE-/-Model組與CSE-/-Sham組比較，以上三項指標也均減少，差異有統計學意義（F=14.9、32.5、26.5，P ＜0.01），且與CSE+/+Model組比較，CSE-/-Model組以上三項指標減少更為顯著，差異有統計學意義（t =3.0、4.3、20.5，P＜0.01）；Hyp 50、100 mg/kg能夠抑制CSE+/+小鼠由于腦缺血再灌注導致的以上三項指標的減少，與CSE+/+Model組比較差異有統計學意義（F=14.9、32.5、26.5，P＜0.05，P＜0.01）；Hyp對腦缺血再灌注后的CSE-/-小鼠以上指標無改善作用，與CSE-/-Model組比較差異無統計學意義。

表1 CSE基因敲除對Hyp促進腦缺血再灌注小鼠跳臺實驗的影響（n=8，）

表1 CSE基因敲除對Hyp促進腦缺血再灌注小鼠跳臺實驗的影響（n=8，）

與CSE+/+Sham組或CSE-/-Sham組比較：＊＊P＜0.01；與CSE+/+Model組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 小鼠基因型 劑量（mg/kg）潛伏期（s）學習 記憶錯誤次數（次）學習 記憶Sham CSE+/+ - 24.4±7.0 182.4±38.2 1.1±0.6 1.2±0.5 CSE-/- - 29.1±8.9 175.2±36.9 1.0±0.5 1.1±0.4 Model CSE+/+ - 40.8±9.5＊＊ 107.6±47.4＊＊ 2.9±0.8＊＊ 2.1±0.6＊＊CSE-/- - 56.6±11.8＊＊## 61.4±28.7＊＊## 4.0±1.1＊＊## 3.5±0.5＊＊##Hyp CSE+/+ 25 40.2±9.9 114.9±57.6 2.8±1.6 1.8±0.9 CSE-/- 25 50.6±20.5 64.9±28.4 3.5±1.2 3.2±1.0 Hyp CSE+/+ 50 31.1±7.1# 126.1±63.7 1.9±0.9# 1.6±0.8 CSE-/- 50 46.6±16.5 68.5±28.7 3.2±1.3 3.0±0.8 Hyp CSE+/+ 100 26.2±12.4## 165.8±51.5# 1.4±0.8## 1.2±0.5#CSE-/- 100 45.5±14.9 72.6±24.0 3.0±1.2 2.9±0.9

表2 CSE基因敲除對Hyp促進腦缺血再灌注小鼠水迷宮空間搜索實驗的影響（n=8，）

表2 CSE基因敲除對Hyp促進腦缺血再灌注小鼠水迷宮空間搜索實驗的影響（n=8，）

與CSE+/+Sham組或CSE-/-Sham組比較：＊＊P＜0.01；與CSE+/+Model組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 小鼠基因型 劑量（mg/kg） 穿臺次數（次） 原平臺象限時間比率（%）原平臺象限游程比率（%）Sham CSE+/+ — 2.88±0.64 38.74±5.62 37.60±4.13 CSE-/- — 2.62±0.52 38.53±5.29 37.26±5.09 Model CSE+/+ — 1.75±0.46＊＊ 25.32±5.14＊＊ 26.50±3.81＊＊CSE-/- — 1.00±0.53＊＊## 15.31±4.16＊＊## 16.12±5.26＊＊##Hyp CSE+/+ 25 1.88±0.64 26.19±4.78 26.48±4.48 CSE-/- 25 1.12±0.35 16.06±3.89 17.73±4.79 Hyp CSE+/+ 50 2.50±0.53# 32.27±5.33# 33.02±4.97##CSE-/- 50 1.25±0.46 17.65±5.46 17.64±4.96 Hyp CSE+/+ 100 2.62±0.52## 35.22±5.65## 36.48±4.43##CSE-/- 100 1.38±0.52 19.22±5.09 18.06±4.33

圖1 CSE基因敲除對Hyp促進腦缺血再灌注小鼠水迷宮定位航行實驗的影響（n=8，）

2.3 CSE基因敲除對Hyp抑制腦缺血再灌注小鼠腦組織LDH活性下降的影響 分別與CSE+/+Sham 和CSE-/-Sham組比較，CSE+/+Model和CSE-/-Model組小鼠腦組織LDH活性均顯著下降，差異有統計學意義（F=23.7、22.2，P＜0.01）；且與CSE+/+Model組小鼠比較，CSE-/-Model組小鼠腦組織中LDH活性下降更為顯著，差異有統計學意義（t=2.5，P＜0.05）；50、100 mg/kg Hyp對腦缺血再灌注引起的CSE+/+小鼠腦組織LDH活性下降有明顯的抑制作用，與CSE+/+Model組比較差異有統計學意義（F= 23.7，P＜0.05，P＜0.01）；在CSE-/-小鼠中Hyp抑制LDH活性下降的作用消失，與CSE-/-Model組比較差異無統計學意義。見圖2。

圖2 CSE基因敲除對Hyp抑制腦缺血再灌注小鼠腦組織LDH活性下降的影響（n=8，）

2.4 CSE基因敲除對Hyp抑制腦缺血再灌注小鼠腦組織 MDA含量升高的影響 分別與 CSE+/+Sham 和 CSE-/-Sham 組比較，CSE+/+Model和CSE-/-Model組小鼠腦組織MDA含量均顯著升高，差異有統計學意義（F=7.6、8.4，P＜0.01）；且與CSE+/+Model組小鼠比較，CSE-/-Model組小鼠腦組織中MDA含量升高更為顯著，差異有統計學意義（t =-2.3，P＜0.05）；Hyp 50、100 mg/kg對腦缺血再灌注引起的CSE+/+小鼠腦組織MDA含量升高有明顯的抑制作用，與CSE+/+Model組比較差異有統計學意義（F=7.6，P＜0.05，P＜0.01）；在CSE-/-小鼠中，Hyp抑制 MDA含量升高的作用消失，與 CSE-/-Model組比較差異無統計學意義。見圖3。

圖3 CSE基因敲除對Hyp抑制腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量升高的影響（n=8，）

3 討論

本課題組前期研究［8］顯示H2S、Hyp和映山紅花總黃酮（TFR）均具有抗腦缺血損傷作用，且TFR抗腦缺血損傷作用與CSE-H2S通路有關，而且Hyp對腦血管的舒張作用與CSE-H2S通路有關。CSE為內源性H2S合成酶，且CSE在腦血管內皮細胞和平滑肌細胞中均有表達。因此本實驗將研究作為TFR主要成分之一的Hyp對腦缺血再灌注損傷的保護作用與CSE-H2S通路的關系。學習和記憶是至關重要的腦功能［9］，腦缺血損傷大多會造成學習記憶能力的下降，跳臺實驗和水迷宮實驗是經典的評價學習記憶能力的兩種行為學實驗。Morris水迷宮實驗是英國心理學家Morris設計的用于研究空間學習記憶的經典實驗，近年來廣泛用于學習記憶方面的研究［10］。跳臺實驗結果顯示，Hyp能夠縮短腦缺血再灌注后CSE+/+小鼠的學習潛伏期，延長記憶潛伏期，并減少學習和記憶的錯誤次數，即Hyp對腦缺血再灌注所致的學習記憶障礙有一定改善作用，但Hyp對腦缺血再灌所致的CSE-/-小鼠學習記憶障礙無改善作用，且與CSE+/+Model組小鼠比較，CSE-/-Model組由于腦缺血再灌注所致的學習記憶障礙更為嚴重，提示內源性H2S的缺失會加重腦缺血再灌注損傷，且Hyp抗小鼠腦缺血再灌注損傷作用與CSE-H2S通路有關。

在水迷宮實驗中，Hyp能夠縮短腦缺血再灌注后CSE+/+小鼠的逃避潛伏期，提高穿過原平臺次數、原平臺象限游程比率及原平臺象限時間比率，即Hyp對腦缺血再灌注所致的學習記憶障礙有改善作用。與小鼠跳臺實驗一致，Hyp對腦缺血再灌注所致的CSE-/-小鼠學習記憶障礙無改善作用，且與CSE+/+Model組小鼠比較，CSE-/-Model組由于腦缺血再灌注所致的學習記憶障礙更為嚴重，水迷宮實驗同樣提示內源性H2S的缺失會加重腦缺血再灌注損傷，且Hyp抗小鼠腦缺血再灌注損傷作用與CSE-H2S通路有關。

腦缺血再灌注損傷由多種復雜因素相互作用導致，其中氧自由基脂質過氧化是腦缺血再灌注損傷的重要原因［11］。腦缺血后，由于腦細胞通透性增加，LDH向外釋放，使得腦組織LDH活性下降，同時腦缺血后會激活一系列酶促反應，促進自由基生成，發生脂質過氧化反應，導致腦組織中脂質過氧化產物MDA含量升高［1］，因此，腦組織LDH活性和MDA含量可以作為評價腦組織損傷的指標［12］。本研究顯示Hyp能夠抑制CSE+/+小鼠由于腦缺血再灌注導致的腦組織 LDH活性的降低，同時抑制MDA含量的升高，但對腦缺血再灌注后的CSE-/-小鼠無此作用，且與CSE+/+Model組小鼠比較，CSE-/-Model組由于腦缺血再灌注所致的腦組織LDH活性的降低、MDA含量的升高更為明顯，提示內源性H2S的缺失會加重腦缺血再灌注損傷，且Hyp抗小鼠腦缺血再灌注損傷作用與CSE-H2S通路有關。

綜上所述，本實驗表明內源性H2S的缺失會加重小鼠腦缺血再灌注損傷，且Hyp抗小鼠腦缺血再灌注損傷作用與CSE-H2S通路有關。

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The H2S mechanism of Hyp against cerebral ischemia reperfusion injury in mice

Gao Shanshan1，Chen Shuo2，Chen Zhiwu1
（1Dept of Pharmacology，2Dept of Physiology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To observe the effect of hydrogen sulfide（H2S）in the protective action of hyperin（Hyp）on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice.Methods Cerebral ischemia/reperfusion models were established in cystathionine γ-lyase（CSE，a generating enzyme of H2S）-knockout（CSE-/-）and wide-type（CSE+/+）mice.The abilities of learning and memory in mice were detected by the step down test and Morris water maze test.The activities of lactate dehydrogenase（LDH）and the contents of malondialdehyde（MDA）in brain tissue were measured.Results After cerebral ischemia/reperfusion，the impairments of learning and memory abilities in mice，reductions of LDH activities and elevations of MDA contents in brain tissue were more obvious in CSE-/-mice than that in CSE+/+mice.Impairments of learning and memory abilities，reductions of LDH activities and elevations of MDA contents were markedly inhibited by Hyp（50，100 mg/kg）in CSE+/+mice rather than that in CSE-/-mice.Conclusion Cerebral ischemia/reperfusion injury is aggravated in the absence of endogenous H2S.CSE-H2S pathway is involved in the protective effect of Hyp on cerebral ischemia/reperfusion injuries in mice.

hyperin；hydrogen sulfide；knockout；cerebral ischemia/reperfusion injuries

R 965

A

1000-1492（2016）09-1292-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.026.html

2016-05-04接收

國家自然科學基金（編號：81173596、81374002）

安徽醫科大學1藥理學教研室、2生理學教研室，合肥230032

高珊珊，女，碩士研究生；陳志武，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：chpharmzw@163.com