犬牙槽骨干細胞與髂骨骨髓干細胞體外成骨能力的比較

鄭文龍，吳 濤，鄒多宏，陳喬爾

犬牙槽骨干細胞與髂骨骨髓干細胞體外成骨能力的比較

鄭文龍1，2，3，吳 濤1，2，3，鄒多宏1，2，3，陳喬爾1，2，3

目的 比較犬牙槽骨來源干細胞（ABSC）和骨髓間充質干細胞（BMSC）的體外成骨能力，為骨組織工程的種子細胞選擇提供新思路。方法 取同一只犬的牙槽骨骨組織和髂骨骨髓作為ABSC和BMSC的來源。取第3代細胞進行一系列體外檢測：MTT法檢測兩種細胞的增殖能力；成骨誘導和常規培養條件下，不同時間點進行茜素紅和堿性磷酸酶染色，觀察鈣鹽沉積和堿性磷酸酶合成能力，同時對細胞內堿性磷酸酶活力進行半定量檢測；成骨誘導后7、14、21 d利用RT-PCR法檢測關鍵性成骨因子［Ⅰ型膠原（COL-1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）］的表達情況。結果 相較BMSC，ABSC增殖能力略高，鈣結節和堿性磷酸酶的表達能力更強。COL-1早期在ABSC中的表達高于BMSC，并隨著時間呈下降趨勢。ALP在ABSC中的表達始終高于BMSC，且在14 d達到最高峰。OCN總體呈上升趨勢，14 d和21 d有明顯表達，且ABSC高于BMSC。結論 犬ABSC的成骨能力與BMSC差別不大，提示犬ABSC可以成為骨組織工程優先選擇的種子細胞之一。

骨髓干細胞；牙槽骨干細胞；成骨分化

研究［1］表明，頜骨組織修復頜面部的骨缺損比使用中軸骨或四肢骨擁有更加穩定的成骨效果，遠期的骨吸收更少。胚胎學證實，頜骨起源于神經嵴，又稱為外胚間葉組織，而軀干四肢骨起源于中胚層［2］。研究［3］顯示，牙槽骨來源干細胞（alveolar bone-derived stem cells，ABSC）和骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BMSC）在胚胎和骨骼系統發育相關基因的表達上存在較大差異。近年來，Clausen et al［4］使用流式細胞術檢測人的ABSC，證明其高表達干細胞表面標志 CD13、CD44、CD90、CD73，低表達CD31，并利用RT-PCR檢測證明了成骨誘導后其成骨相關基因的高表達。Payer et al［5］證明ABSC在體外培養下具有成骨和成脂的潛能。研究［6］證明，頜骨BMSC比髂骨BMSC具有更高的神經向分化能力。以上結果說明，牙槽骨中具有多項分化潛能的干細胞，在組織工程中有巨大的潛力。該研究旨在比較ABSC和BMSC的體外成骨能力，為其將來更好地應用于組織工程提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 拉布拉多犬，1.5歲，18～20 kg，雄性，飼養于安徽醫科大學動物實驗中心。

1.1.2 實驗試劑 DMEM培養基、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、茜素紅（美國Sigma公司）；胎牛血清、BCI/PNBT堿性磷酸酯顯色試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；逆轉錄試劑盒、qPCR反應試劑盒（大連TaKaRa公司）。

1.1.3 實驗儀器 CO2細胞培養孵箱（美國Thermo公司）；I型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；熒光倒置相差顯微鏡和照相系統（德國Leica公司）；實時熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司）；低溫高速離心機（德國eppendorf公司）；自動細胞計數分析儀（北京京百卓顯公司）；全自動酶標儀（美國BioTek公司）；生物安全柜（中國ESCO公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 ABSC的培養：使用3%的戊巴比妥鈉對拉布拉多犬進行靜脈麻醉，然后固定于操作臺，備皮、消毒，拔去犬的上頜前磨牙，從牙槽骨壁及其周圍獲得牙槽骨并送實驗室培養。PBS沖洗3遍，去除血凝塊，使用無菌器械將牙槽骨剪碎成大小約2 mm×2 mm×2 mm，加入含10%FBS的DMEM，于37℃、5%CO2的孵箱中進行培養。接種5～7 d后進行觀察，換液。此后每隔3 d細胞全換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。BMSC的培養：對犬的髂骨進行穿刺獲得5～8 ml骨髓，置入含肝素鈉的離心管，送實驗室采用全骨髓貼壁法培養細胞。5 d后小心吸取培養液和未貼壁細胞進行首次換液。當ABSC和BMSC細胞生長融合約80%～90%時，用0.25%胰酶消化傳代。第3代細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 取第3代兩種細胞，分別以1×104/ml接種于96孔板，每孔200 μl完全培養基，每組5個復孔；使用MTT法，通過酶標儀測兩者的吸光度（optical density，OD值），連續測9 d，繪制生長曲線。

1.2.3 成骨誘導分化后鈣結節和ALP的染色 取第3代兩種細胞，分別以5×104/ml的密度接種于24孔板培養，每孔0.5 ml，每組6個復孔。當細胞貼壁生長達90%匯合后，加入成骨誘導液（含10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-7mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C）進行誘導培養。培養約7、14、21 d行茜素紅和ALP染色，掃描并于倒置顯微鏡下觀察。ABSC和BMSC的鈣結節面積比較，則將染色后培養皿放在網格板上，平均分9個視野，取上、下、左、右和中間5個視野，拍照后，使用Image Pro Plus軟件計算鈣結節所占面積。

1.2.4 ALP相對活力的檢測 取第3代兩種細胞，分別以5×104/ml的密度接種于10 cm板，每板10 ml。當細胞貼壁生長達90%匯合后，加入成骨誘導培養液進行誘導培養。另設置對照組，不加入成骨誘導液，只加普通的培養基。每3 d換液1次。第7、14、21天提取蛋白，使用對硝基苯磷酸二鈉法（pNPP法）對ALP的含量進行測定。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析成骨相關基因的表達 取第3代兩種細胞，分別以5×104/ml的密度接種于6孔板，每孔2 ml。成骨誘導7、14、21 d后，使用TRIzol試劑分別提取其總的RNA，對收集的RNA進行純度與量的測定，逆轉錄合成cDNA，然后進行實時熒光定量PCR，反應體系為20 μl。擴增基因為I型膠原（collagen I，COL-1）、ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及內參基因β-actin。實驗重復3次。引物由上海生工生物工程公司進行設計（表1）。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行分析，兩組數據間的比較采用獨立樣本t檢驗，數據以表示。

2 結果

2.1 犬ABSC和BMSC的形態學觀察 ABSC從骨組織邊緣遷移出來，其大小形態等與BMSC相似，如單細胞核、成纖維樣（圖1）。原代細胞傳代時使用細胞計數儀對其進行檢測，兩者的活力可達95%以上。在第3代至第7代細胞活力沒有明顯下降趨勢。

表1 犬引物基因序列表

2.2 犬ABSC和BMSC生長曲線的比較 MTT結果顯示ABSC在擴增的第1～3天，兩組細胞增殖情況基本一致，第4天后ABSC增殖速度略高于BMSC，差異有統計學意義（P＜0.05），9 d后，ABSC基本趨于穩定（圖2）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養BMSC和ABSC ×40

2.3 成骨誘導后鈣結節和ALP的染色 茜素紅染色：成骨誘導14 d時，茜素紅染色可見ABSC中有局部散在的鈣化結節且多余BMSC。21 d時，ABSC的礦化結節面積較大且稠密，明顯多于BMSC。Image-Pro Plus 6.0軟件分析表明，ABSC其鈣結節面積百分比高于 BMSC，差異有統計學意義［14 d：（31.5±1.7）%vs（25.7±0.6）%，t=5.432，P＜0.05；21 d：（59.5±1.4）%vs（35.6±0.5）%，t=27.304，P＜0.05］，見圖3。ALP染色：成骨誘導7 d時，可見ABSC的皿底散在分布著藍紫色的顆粒沉淀，而BMSC僅有皿底中央區域散在分布的著色點。隨著誘導時間的增加，ALP越來越多。21 d時，可見ABSC的ALP表達明顯高于BMSC（圖4）。

圖2 第3代ABSC和BMSC生長曲線比較

圖3 ABSC和BMSC誘導14 d和21 d后茜素紅染色掃描和鏡下（×40）以及兩者鈣結節面積所占百分比

圖4 ABSC和BMSC誘導7 d和21 d后ALP染色掃描和鏡下 ×40

2.3 ALP活力相對定量檢測 非誘導組中，ABSC 中ALP在14 d之后較為穩定，BMSC則一直較為穩定。成骨誘導后，ABSC中ALP增加趨勢明顯，BMSC中ALP在21 d才有明顯增加，每個時間點ABSC 中ALP的活性均高于BMSC，差異有統計學意義（7 d：t=0.868，14 d：t=6.439，21 d：t=1.940，P＜0.05），見圖5。

圖5 ABSC和BMSC成骨誘導與常規培養ALP活力相對定量

2.4 成骨誘導后成骨相關基因的表達 RT-PCR結果顯示，成骨誘導培養后，ABSC和BMSC的成骨相關基因COL-1、ALP、OCN都有差異表達。7、14 d，COL-1在 ABSC中的表達高于 BMSC（7 d：t= 37.283，14 d：t=14.900），且COL-1在兩種細胞中的表達隨著時間呈下降趨勢。ALP在兩組細胞的表達在14 d達到最高峰，且ABSC的ALP的表達始終高于BMSC（7 d：t=12.674，14 d：t=7.007，21 d：t =6.099）。OCN隨著誘導時間在兩種細胞中均呈上升趨勢，14 d和21 d的OCN在ABSC的表達高于BMSC（14 d：t=36.908，21 d：t=23.938），以上差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖6。

3 討論

有關頜骨內干細胞的研究之前多是從頜骨中進行骨髓的抽取并進行相關的實驗，而對于從頜骨骨松質中遷移出來的干細胞研究相對較少。研究［7］表明，從頜骨骨髓、骨松質或者兩者混合物中生長出來的干細胞，三者在早期的細胞增殖速度上有所區別，但是在干細胞表面標志的表達上沒有明顯的區別。在30代內，三者沒有致癌基因的異常表達，35代后才有核型異常的發生。Akintoye et al［8］報道，人類的頜骨中含有更少的造血干細胞，并顯示較高的增殖能力和骨向分化能力。但是，在裸鼠皮下試驗中，BMSC的成骨能力卻又高于ABSC。研究［9］表明，不管是體外還是體內試驗，大鼠的ABSC成骨能力均高于脛骨來源的間充質干細胞。Matsubara et al［10］報道人和犬的ABSC和BMSC具有相似的成骨能力，但是成軟骨和成脂肪能力卻有不同。Pekovits et al［11］報道，人類下頜骨骨松質與髂骨骨髓來源的干細胞的增殖能力沒有明顯差別。盡管這些研究結果之間存在著爭議，但是多數研究［9-11］表明ABSC 和BMSC確實存在位點差異。出現這些爭議有可能是因為實驗對象（物種、年齡）、研究方法的不同導致。解剖位點的差異主要受以下因素影響：①血供區域的不同；②骨皮質和骨松質數量與結構的不同；③ 空間物理結構的不同；④ 基因表達的不同［12］。從胚胎發育來看，頜骨起源于外胚層的神經嵴，并經歷骨膜內成骨過程。軀干四肢骨起源于中胚層的間葉細胞，并經歷軟骨成骨［2］。胚胎發生的不同對兩者在骨骼系統發育相關基因的表達上會產生一定的影響，并影響著疾病的發生。如巨頜癥、甲狀旁腺亢進-頜骨腫瘤綜合征等僅發生在頜骨。除此之外，頜面部的骨纖維異常增殖癥在組織學和影像學上與中軸骨和四肢骨也有明顯的不同。近期，有很多關于下頜骨長期使用抗吸收劑（二碳磷酸鹽）導致骨壞死發生的病例。然而將二碳磷酸鹽應用于中軸骨，僅僅導致輕微骨折而不是骨壞死［3］。

圖6 ABSC和BMSC在成骨誘導后，骨相關基因的表達

本次研究所選擇的干細胞已經被證實具有多向分化潛能，并具有較強的成骨特性［13］。為使干細胞更快的從骨松質中遷移出來，研究者使用膠原酶對骨組織進行了處理，這不可避免的對細胞的狀態會產生一定的影響［8］。為了排除干擾，此次實驗并未使用膠原酶。由于細胞增殖能力強，為保證在觀察期內細胞不受接觸抑制繼續生長，MTT實驗中的細胞濃度控制在1×104/ml。實驗結果說明，ABSC的增殖能力高于BMSC，這與之前的研究［8］結果相一致。研究［3］顯示，ABSC的同源異型盒基因家族的MSX基因相對BMSC高表達，而MSX作為核轉錄因子對細胞的增殖能力具有較強的控制能力。

ALP雖然是成骨分化的早期標志物，但是在骨細胞的形成期表達依然存在。因此本實驗通過ALP半定量和ALP染色檢測成骨誘導7、14、21 d的變化情況。鈣結節是成骨分化的晚期標志物，因此選擇檢測的時間為14、21 d。為使細胞更快地增殖和匯集，進行骨誘導培養，實驗中選擇細胞濃度為5× 104/ml。鏡下顯示ALP和鈣結節特別容易在皿底中央聚集，這可能是由于高密度狀態更容易表現出骨向分化趨勢。ALP是細胞成骨向分化的早期分泌產物，在ABSC中早期就有表達，說明ABSC的成骨分化趨勢更加明顯。鏡下顯示，不同細胞間著色程度不同，這可能是因為即使是同一批傳代的細胞，每個細胞個體的分化潛能也存在著差異。此次研究培養的是混合型細胞群，并不是所有細胞均具有三系分化的潛能，能分化的干細胞只是其中一部分［11］。ALP半定量結果顯示，ABSC的ALP活力高于BMSC，這與研究［8-9］結果一致。ABSC在誘導和非誘導情況下ALP活力的表達存在較大差異，說明ABSC更容易受到骨誘導的影響。

本實驗采用COL-1、ALP、OCN 3種骨向分化相關基因作為RT-PCR的檢測指標，COL-1、ALP基因是成骨分化的早期標志物，OCN是成骨分化的晚期標志物。RT-PCR的結果表明，COL-1、ALP在ABSC中的高表達，有利于其成骨早期分泌更多的礦化基質，這與ALP染色和ALP半定量結果相符。OCN的表達隨著時間逐漸增加與細胞進入礦化期有關，有利于形成更多的鈣結節，其在ABSC中的高表達與茜素紅的染色結果一致。

以上結果說明：ABSC的成骨能力與BMSC差別不大，是骨組織工程中很有潛力的種子細胞，其深入機制還有待進一步研究。

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Canine alveolar bone-derived stem cells and bone marrow mesenchymal stromal cells：a comparative study of the osteogenic potential

Zheng Wenlong1，2，3，Wu Tao1，2，3，Zou Duohong1，2，3，et al
（1Stomatologic College of Anhui Medical University，2The Affiliated Stomatologic Hospital
of Anhui Medical University，3Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To compare the osteogenic ability of two different canine stem cells in the application of bone tissue engineering in vitro，namely alveolar bone-derived stem cells（ABSC）and bone marrow mesenchymal stromal cells（BMSC）.Methods ABSC and BMSC were prepared from the alveolar bone and bone marrow of a dog. The third generation of these cells were used for the following studies.Firstly，the proliferation of the two cells was detected by MTT assay.Secondly，after osteogenic induction，the osteogenic ability was detected by alizarin red staining and alkaline phosphatase staining.Thirdly，after osteogenic induction for 7，14 and 21 d，the activity of intracellular alkaline phosphatase was detected by the pNPP method.Fourthly，after osteogenic induction，the expression of collagenⅠ（COL-1），alkaline phosphatase（ALP）and osteocalcin（OCN）was analyzed by RT-PCR.Results ABSC showed higher proliferative ability.After osteogenic induction，ABSC produced more calcium nodules and alkaline phosphatase.The results showed that the expression of COL-1 in ABSC was higher than that in BMSC and both of them decreased gradually.The expression of ALP in them reached the highest peak at 14 d.OCN was significantly expressed in ABSC at 14 and 21 d，and was higher in BMSC.Conclusion The osteogenic abilities of ABSC are similar to that of BMSC，which is an ideal seed cell in the research of bone tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stromal cells；alveolar bone-derived stem cells；osteogenic differentiation

R 78.02

A

1000-1492（2016）09-1252-06

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.010.html

2016-06-03接收

國家自然科學基金（編號：31370983）

1安徽醫科大學口腔醫學院、2安徽醫科大學附屬口腔醫

院、3安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032作者簡介：鄭文龍，男，碩士研究生；

陳喬爾，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：chqe0111 @163.com