褪黑素對大鼠肝纖維化的保護作用及其對TGF-β1表達的影響

汪玉榮，洪汝濤，謝園園

褪黑素對大鼠肝纖維化的保護作用及其對TGF-β1表達的影響

汪玉榮，洪汝濤，謝園園

目的 探討褪黑素對大鼠肝纖維的保護作用及其對轉化生長因子β1（TGF-β1）表達的影響。方法 選擇60只雄性SD大鼠，隨機分為正常組、模型組、褪黑素低劑量組及褪黑素高劑量組，每組15只。采用連續6周皮下注射CCl4方法制備肝纖維化大鼠模型。生化法測定大鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）活性及白蛋白（ALB）含量。分光光度計法測定肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量；HE染色及Van Gieson（VG）染色方法評價肝臟病理改變；免疫組化法測定肝組織中TGF-β1的表達。結果 與模型組相比，褪黑素處理組大鼠血清ALT、AST活性明顯降低（P＜0.01），褪黑素高劑量組大鼠血清ALB含量明顯升高（P＜0.05）；褪黑素處理組大鼠肝組織Hyp含量較模型組明顯降低（P＜0.01）；褪黑素高劑量組大鼠纖維病理評分明顯低于模型組（P＜0.05）；TGF-β1在褪黑素處理組大鼠肝臟中的表達較模型組明顯較少（P＜0.01）。結論 褪黑素對大鼠肝纖維化有保護作用，其可能的作用機制為抑制TGF-β1的表達。

褪黑素；肝纖維化；轉化生長因子β1

肝纖維化為慢性肝病的共同病理特征，最終可發展為肝硬化甚至原發性肝癌，嚴重威脅人類健康。研究［1］證明肝纖維化為一動態過程，可逆轉。但是目前臨床尚無治療肝纖維化很有效的藥物。褪黑素作為松果腺體分泌的一種重要激素，對肝纖維化具有保護作用，且機制與其強大的抗氧化作用有關［2］。但是褪黑素抗纖維化的作用機制尚不完全清楚。轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作為肝纖維化氧化應激過程產生的重要細胞因子，在肝纖維化的發生發展中起著重要作用，抑制TGF-β1的表達可改善肝纖維化［3］。該研究探討褪黑素對CCl4致大鼠肝纖維化的保護作用及其對TGF-β1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只普通級SD雄性大鼠，180～220 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，標準環境適應性飼養1周，提供正常飲食。

1.2 主要試劑及儀器 褪黑素購于美國Sigma公司，溶解于酒精及0.9%生理鹽水中（酒精含量≤1%）；CCl4購于國藥集團化學試劑合肥有限公司；Van Gieson（VG）染色試劑盒購于珠海貝索生物技術有限公司；組織蛋白及羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；兔多克隆抗體TGF-β1抗體購于美國Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗試劑盒及DAB試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司；瑞士Roche Modular DPP全自動生化分析儀購于瑞士羅氏公司；752 N分光光度計購于上海綠宇生物科技有限公司；光學顯微鏡及倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.3 動物處理 SD大鼠被隨機分為正常組、模型組、褪黑素低劑量組及褪黑素高劑量組，每組15只。將CCl4與精制花生油以2∶3的體積比制成40% CCl4。模型組及褪黑素處理組給予40%CCl43 ml/ kg，正常組給予等體積花生油，皮下注射，每周2次，連續6周。自皮下注射CCl4之日起，腹腔注射褪黑素：褪黑素低劑量組5.0 mg/kg，褪黑素高劑量組10.0 mg/kg，正常組及模型組給予等體積1%乙醇溶液（乙醇+生理鹽水），每天1次，連續6周。每周稱大鼠體重1次，根據體重調整用藥劑量。6周末，所有動物禁食12 h后以10%水合氯醛麻醉處死，腹主動脈取血，4℃、5 000 r/min離心15 min，收集血清標本，并取新鮮肝臟同一部位用10%中性甲醛固定，以備石蠟包埋行病理及免疫組化檢查，其余肝臟組織放入液氮中備用。

1.4 血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）及白蛋白（ALB）含量的測定 大鼠血清ALT、AST 及ALB水平采用瑞士Roche Modular DPP全自動生化分析儀進行測定。

1.5 肝組織Hyp含量測定 精確稱取新鮮肝臟組織100 mg，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作，采用分光光度計測定吸光度值，計算大鼠肝組織Hyp的含量。采用考馬斯亮藍法測定肝組織蛋白含量。

1.6 病理學檢查 取同一部位肝臟組織行10%中性甲醛固定、石蠟包埋并5 μm連續切片。按常規步驟行HE染色，按試劑盒說明書步驟行VG染色，光學顯微鏡下觀察病理結果。按Metavir半定量評分系統［4］進行肝纖維化病理評分，0：正常肝臟；1：匯管區纖維化，無纖維間隔；2：匯管區纖維化，少量纖維間隔；3：匯管區纖維化，纖維間隔很多，無肝硬化；4：肝硬化。

1.7 免疫組化法測定肝組織中TGF-β1表達 石蠟包埋組織塊，5 μm連續切片，常規脫蠟至水，0.5%～1.0%過碘酸30 s滅活內源性過氧化物酶，放入微波爐中檸檬酸鹽抗原修復（1次2 min，循環5次），予以正常山羊血清行抗原封閉，加入一抗TGF-β1（1∶450），4℃孵育過夜，按試劑盒說明書步驟加二抗，加DAB鏡下顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封片。每批實驗均以PBS液代替一抗設置陰性對照。有明顯黃色/棕黃色/褐色顆粒的細胞為陽性細胞。每張切片隨機選取5個不連續的視野（×400），用O-lympus倒置顯微鏡攝片，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定光密度（optical density，OD）值，計算平均OD值作為該切片的OD值。

1.8 統計學處理 采用 SPSS 17.0進行統計學分析。計量資料以表示，單因素方差分析進行組間比較，LSD法進行兩組間比較。等級資料采用Ridit檢驗方法進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝功能測定結果 模型組大鼠死亡2只，其余3組大鼠均未見死亡。與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST活性明顯升高，ALB含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素低劑量組大鼠血清ALT、AST活性明顯降低（P＜0.01），血清ALB含量差異無統計學意義（P＞0.05），褪黑素高劑量組大鼠血清ALT、AST活性明顯降低（P＜0.01），ALB含量明顯升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 大鼠肝組織Hyp含量測定結果 與正常組比較，模型組大鼠肝組織Hyp含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝組織Hyp含量明顯降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織Hyp的含量

2.3 大鼠肝臟病理檢查結果 HE及VG染色結果顯示：正常組大鼠肝小葉結構正常，幾乎無膠原纖維沉積；模型組大鼠肝臟肝細胞腫大、脂肪變性及炎癥細胞浸潤明顯，且肝小葉尤其匯管區膠原蛋白沉積明顯，纖維間隔顯著；褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝小葉肝細胞脂肪變性明顯，炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積程度較模型組明顯減少。見圖2、3。與正常組相比，模型組大鼠纖維化病理分級評分明顯升高（U＞2.58，P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素高劑量組大鼠纖維化病理分級評分明顯降低（U＞1.96，P＜0.05）。褪黑素低劑量組與模型組纖維化病理分級評分差異無統計學意義（U＜1.96，P＞0.05）。見表2。

圖2 各組大鼠肝臟病理HE染色 ×200

2.4 大鼠肝臟TGF-β1表達結果 TGF-β1主要表達于肝臟組織中肝星狀細胞、竇內皮細胞及纖維化附近的炎癥細胞胞質中。正常組大鼠肝臟組織中未見棕黃色、褐色陽性顆粒，TGF-β1幾乎無

表1 褪黑素對CCl4肝纖維化大鼠肝功能的影響（）

表1 褪黑素對CCl4肝纖維化大鼠肝功能的影響（）

與正常組比較：＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

組別 數量 ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L）正常 15 48.00±13.37 157.27±16.18 33.49±3.00模型 13 336.92±26.48＊＊ 438.15±26.79＊＊ 28.43±3.28＊＊褪黑素低劑量 15 222.27±28.43## 313.80±21.23## 30.83±4.07褪黑素高劑量 15 202.20±27.09## 281.53±25.57## 31.04±3.11#

圖3 各組大鼠肝臟病理VG染色 ×200

表2 褪黑素對大鼠肝組織肝纖維化病理分級評分的影響

模型組大鼠肝臟組織中可見明顯的棕黃色及褐色顆粒，且主要位于匯管區纖維組織中，TGF-β1表達較正常組明顯增加。褪黑素低劑量及高劑量組大鼠肝臟組織中可見棕黃色陽性顆粒，且主要位于匯管區，但是陽性顆粒較模型組明顯減少，TGF-β1表達量較模型組明顯減少。見圖4。與正常組相比，模型組大鼠肝臟TGF-β1表達量明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝臟TGF-β1表達量明顯減少（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種致病因素持續或反復損傷的一種慢性修復反應，以細胞外基質及膠原纖維的過度沉積為特征［5］。Hyp主要存在于膠原蛋白中，其他蛋白中含量極少或不存在，故其含量的測定可用于反映纖維化嚴重程度［6］。本研究采用連續6周皮下注射CCl4制備大鼠肝纖維化模型。與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST活性明顯升高，血清ALB含量明顯降低，肝組織Hyp含量明顯增加，肝臟組織肝細胞變性壞死及炎癥細胞浸潤明顯，匯管區纖維沉積及肝小葉纖維間隔明顯增加，肝臟纖維化病理分級評分明顯增加，說明CCl4誘導的肝纖維化模型制備成功。與模型組相比，褪黑素低劑量組及高劑量組大鼠肝功能明顯改善，肝組織Hyp含量明顯減少，且肝臟炎癥壞死及纖維沉積程度均明顯降低，可見褪黑素對CCl4誘導的大鼠肝纖維化具有明顯的保護作用。

圖4 各組大鼠肝組織TGF-β1表達情況 ×400

圖5 各組大鼠肝組織TGF-β1的表達

褪黑素（N-乙酰-5-甲氧色氨酸）是松果腺體分泌的一種神經內分泌激素，有強大的自由基清除能力，是一種很強的抗氧化劑。褪黑素除清除自由基直接抗氧化作用外，還能提高機體抗氧化酶活性間接增強機體抗氧化功能［7］。研究［8-9］證明褪黑素能減輕多種原因導致的肝纖維化，且作用機制與抗氧化作用相關。

氧化應激促進肝纖維化發生發展過程中，大量細胞因子得以產生并釋放，加速肝纖維化的發生發展，其中TGF-β1是最重要的促纖維化細胞因子［10］。TGF-β1主要通過活化肝星狀細胞促進肝纖維化的形成：肝臟接受各種病理刺激時，肝內庫普弗細胞、竇內皮細胞及血小板釋放TGF-β1，激活靜止狀態的肝星狀細胞，活化的肝星狀細胞釋放更多的TGF-β1并進一步促進自身的增殖及活化，活化的肝星狀細胞合成大量的細胞外基質并沉積于肝臟內。TGF-β1除直接激活肝星狀細胞合成細胞外基質外，其還能通過抑制組織金屬蛋白酶并促進組織金屬蛋白酶抑制劑而減少細胞外基質的降解，從而間接促進肝纖維化［11］。研究［12-13］表明減少 TGF-β1表達可抑制肝纖維化的發生發展。目前未見有關褪黑素對纖維化肝臟TGF-β1表達影響的報道。故本研究探討褪黑素對肝纖維化大鼠的保護作用及其對TGF-β1表達的影響。

免疫組化方法結果顯示：TGF-β1在正常組大鼠肝臟組織中幾乎無表達；模型組大鼠肝臟組織TGF-β1表達量明顯增加；褪黑素低劑量及高劑量組大鼠肝臟組織TGF-β1表達量明顯低于模型組。結果說明褪黑素對CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1的表達具有抑制作用。褪黑素對TGF-β1的抑制作用與其保護肝纖維化作用相一致，故考慮褪黑素抗纖維化作用機制可能與抑制肝臟TGF-β1的表達相關。

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Protective effects of melatonin on hepatic fibrosis in rats and its inhibitory effects on TGF-β1

Wang Yurong，Hong Rutao，Xie Yuanyuan
（Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，
Key Laboratory of Disease of Anhui Province，Hefei 230022）

Objective To investigate the protective effects of melatonin on hepaticfibrosis in rats and its effects on the expression of transforming growth factor β1（TGF-β1）in liver.Methods 60 male SD rats were divided randomly into the normal group，the model group and melatonin-treated groups（5.0 mg/kg，10.0 mg/kg；n=15respectively）.The model of liver fibrosis was induced by carbon tetrachloride（CCl4）subcutaneously for 6 weeks continuously.The serum activities of aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）and the levels of albumin（ALB）were detected by an autoanalyzer.The levels of hydroxyproline（Hyp）in liver were measured by spectrophotometry.Changes in liver pathology were examined by hematoxylin and eosin（HE）staining and Van Gieson（VG）staining.The expression of TGF-β1 in liver tissue was evaluated by immunohistochemistry.Results Compared with the model group，serumactivities of ALT and AST were decreased significantly in melatonintreated groups（P＜0.01）.The levels of serum ALB were increased significantly in melatonin-treated group（10.0 mg/kg）compared with the model group（P＜0.05）.In comparison with the model group，the levels of Hyp in liver were decreased significantly in melatonin-treated groups（P＜0.01）.Pathologic grading score of melatonin-treated group（10.0 mg/kg）was much lower than that of the model group（P＜0.05）.The expression of TGF-β1 in liver was decreased remarkably in melatonin-treated groups compared with the model group（P＜0.01）.Conclusion Melatonin protects liver fibrosis，one mechanism of which may be related to the inhibition of TGF-β1 expression in liver.

melatonin；liver fibrosis；transforming growth factor β1

R 575.2

A

1000-1492（2016）09-1248-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.008.html

2016-04-16接收

安徽高校省級科學研究項目（編號：KJ2013A155）

安徽醫科大學第一附屬醫院消化內科，安徽省消化疾病重點實驗室，合肥 230032

汪玉榮，女，碩士研究生；洪汝濤，男，主任醫師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：hongrutao@163.com