小鼠腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的鑒定及其晝夜發(fā)放頻率

丁正霞，薛 天，鮑 進(jìn)，王 媛，張 瑾，王烈成

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

小鼠腹外側(cè)視前區(qū)神經(jīng)元的鑒定及其晝夜發(fā)放頻率

丁正霞1，薛 天2，鮑 進(jìn)2，王 媛1，張 瑾1，王烈成1

目的 鑒定腹外側(cè)視前區(qū)（VLPO）的神經(jīng)元，記錄神經(jīng)元在晝夜的動(dòng)作電位（AP）的發(fā)放頻率，揭示不同VLPO神經(jīng)元晝夜發(fā)放的規(guī)律。方法 4～6周齡野生型小鼠新鮮腦片，根據(jù)形態(tài)、對(duì)藥物去甲腎上腺素的響應(yīng)及電特性對(duì)VLPO的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定；膜片鉗方式記錄VLPO區(qū)域的神經(jīng)元在白天的11：00～16：00以及夜間的22：00～02：00動(dòng)作電位的發(fā)放；采用t檢驗(yàn)對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 成功在VLPO鑒定出兩類神經(jīng)元，一類為多極三角形、去甲腎上腺素抑制性神經(jīng)元，其閾值有低閾值發(fā)放（LTS）特性；一類呈兩極梭形、去甲腎上腺素興奮性神經(jīng)元，其閾值無(wú)LTS特性。在記錄的59個(gè)VLPO區(qū)域的神經(jīng)元中，LTS特性的神經(jīng)元有44個(gè)，非LTS特性的有15個(gè)；t檢驗(yàn)分析顯示去甲腎上腺素抑制的、有LTS特性的神經(jīng)元在白天動(dòng)作電位的發(fā)放頻率明顯高于夜間神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放頻率（P＜0.01）；去甲腎上腺素興奮的、非LTS特性的神經(jīng)元白天動(dòng)作電位的發(fā)放頻率也明顯高于夜晚動(dòng)作電位的發(fā)放頻率（P＜0.05）。結(jié)論 VLPO存在兩類神經(jīng)元，這兩類神經(jīng)元的白天動(dòng)作電位發(fā)放頻率皆高于夜間動(dòng)作電位發(fā)放頻率，提示兩類神經(jīng)元都參與了晝夜節(jié)律的調(diào)控。

腹外側(cè)視前區(qū)；動(dòng)作電位；LTS；非LTS

2000年，Saper et al［1］成功地在下丘腦前部分離出一個(gè)促睡眠的腦區(qū)—腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateral preoptic nucleus，VLPO），實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示VLPO是體內(nèi)重要的促睡眠調(diào)節(jié)中樞之一［2］。Gallopin et al［3］根據(jù)神經(jīng)元的形態(tài)、大小、對(duì)藥物的響應(yīng)、遞質(zhì)的組成在VLPO區(qū)域成功的區(qū)分出兩類神經(jīng)元，并將它們命名為促睡眠神經(jīng)元與中間神經(jīng)元。但VLPO區(qū)域的神經(jīng)元與晝夜節(jié)律的內(nèi)在聯(lián)系卻鮮有報(bào)道。該研究試圖通過(guò)單細(xì)胞腦片膜片鉗記錄的方式，對(duì)VLPO區(qū)域神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，并試圖通過(guò)比較神經(jīng)元在晝夜的發(fā)放頻率，探討其在晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性純種健康成年C57BL/6小鼠30只，4～6周齡，20～25 g，由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室薛天研究組提供。小鼠置于透明有機(jī)玻璃鼠籠（長(zhǎng)37 cm，寬15 cm，高17 cm）內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)，12 h：12 h明暗交替（光照08：00～20：00），室溫（22±2）℃。

1.2 電生理溶液配制 切片液（mmol/L）：NMDG 92、HCl 92、KCl 1.2、KH2PO41.2、NaHCO330、Glucose 25、HEPES 20、L-corbic 5、Na-pyruvate 3、Thiourea 2、MgSO410、CaCl20.5，滲透壓（310±5）mOsm，pH為（7.4±0.1），4℃保存。內(nèi)液（mmol/L）：Kgluconate 135、KCl 10、HEPES 10、EGTA 0.1、ATP-Mg 5、GTP-Na 0.5，滲透壓（310±5）mOsm，pH為（7.2± 0.1），-20℃保存。外液（mmol/L）：NaCl2125、KCl 1.25、KH2PO41.25、NaHCO325、Glucose 25，滲透壓（310±5）mOsm，pH為（7.2±0.1），4℃保存。所有試劑購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 小鼠腦切片 小鼠經(jīng)異氟烷（0.04%）氣體麻醉后斷頭取腦，在冰盒上用吉利刀片修整腦片，并將修整好的腦片用502膠水固定在Leica VT-1200S切片機(jī)的底座上，加入切片液的冰水混合物，以300 μm的厚度開始水平切片，對(duì)照小鼠腦圖譜［4］，將含有VLPO的腦片轉(zhuǎn)移到36.5℃恒溫外液中，通95% O2、5%CO2混合氣，孵育30～45 min。

1.4 玻璃電極的拉制 用SUTTER INSTRUMENT P-1000電極拉制儀拉制尖端為1 μm、入液電阻為5 ～7 MΩ的玻璃電極。

1.5 膜片鉗記錄及數(shù)據(jù)分析 將孵育完成的腦片放在記錄槽中，轉(zhuǎn)移到Scientifica SS600電生理臺(tái)上，用通95%O2、5%CO2混合氣的新鮮外液對(duì)記錄槽中的腦片進(jìn)行灌流。40倍鏡下找到VLPO神經(jīng)元。判斷神經(jīng)元的形態(tài)，隨后用玻璃電極patch細(xì)胞，進(jìn)入全細(xì)胞記錄模式。電流鉗模式下記錄神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)放，用氣壓給藥的方式給予1～3 s、300 μmol/L重酒石酸去甲腎上腺素（上海禾豐有限公司），觀察神經(jīng)元對(duì)藥物的響應(yīng)；靜息膜電位水平下向神經(jīng)元注入1 s、-60 pA電流，觀察神經(jīng)元從超極化膜電位恢復(fù)到靜息膜電位時(shí)是否產(chǎn)生動(dòng)作電位；分別在白天的11：00～16：00以及夜晚的22：00 ～02：00記錄神經(jīng)元的自發(fā)放電，比較白天與夜晚神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放頻率的差異。

2 結(jié)果

2.1 VLPO區(qū)域神經(jīng)元的不同形狀及對(duì)去甲腎上腺素的不同響應(yīng) 顯微鏡下觀察顯示，在VLPO腦區(qū)中有兩種不同形態(tài)的神經(jīng)元，一類呈多極三角形（圖1A），正常狀態(tài)下該神經(jīng)元的發(fā)放是連續(xù)的，給予去甲腎上腺素（300 μmol/L）后神經(jīng)元的發(fā)放受到抑制，藥物撤掉以后神經(jīng)元又恢復(fù)到正常的發(fā)放頻率（圖2A）；一類呈兩極梭形（圖1B），正常狀態(tài)下該神經(jīng)元的發(fā)放是連續(xù)的，給予去甲腎上腺素（300 μmol/L）后神經(jīng)元的發(fā)放頻率進(jìn)一步增加，藥物撤掉以后該神經(jīng)元又恢復(fù)到正常的發(fā)放頻率（圖2B）。

圖1 小鼠腦片上VLPO區(qū)域不同神經(jīng)元的形態(tài)

2.2 VLPO區(qū)域神經(jīng)元的不同電特性 電流鉗模式下，在神經(jīng)元靜息膜電位水平的基礎(chǔ)上向神經(jīng)元注入-60 pA的超極化刺激，注入時(shí)間為1 s，觀察神經(jīng)元從超極化膜電位水平恢復(fù)到靜息膜電位水平時(shí)是否產(chǎn)生動(dòng)作電位。去甲腎上腺素抑制性神經(jīng)元從超極化膜電位水平恢復(fù)到靜息膜電位水平時(shí)能產(chǎn)生動(dòng)作電位，且閾值比靜息膜電位水平下產(chǎn)生動(dòng)作電位的閾值低，紅色星號(hào)表示神經(jīng)元從超極化膜電位水平恢復(fù)到靜息膜電位水平時(shí)產(chǎn)生動(dòng)作電位的位置（圖3A），這種電特性稱作低閾值發(fā)放（LTS）。而去甲腎上腺素興奮性神經(jīng)元無(wú)LTS特性（圖3B）。黑線表示沒(méi)有給任何刺激的情況下神經(jīng)元的自發(fā)放電，藍(lán)線顯示注入電流（-60 pA，1 s）使神經(jīng)元超極化。在記錄的59個(gè)VLPO區(qū)域的神經(jīng)元中，有LTS特性的神經(jīng)元有44個(gè)，非LTS神經(jīng)元有15個(gè)。

圖2 VLPO區(qū)域神經(jīng)元對(duì)去甲腎上腺素的不同響應(yīng)

圖3 小鼠腦片上VLPO區(qū)域兩類神經(jīng)元的不同電特性

2.3 VLPO區(qū)域神經(jīng)元在白天和夜晚呈現(xiàn)出不同動(dòng)作電位發(fā)放頻率 分別在白天的11：00～16：00以及夜間的22：00～02：00記錄VLPO區(qū)域神經(jīng)元的發(fā)放。通過(guò)比較顯示，有LTS特性的神經(jīng)元在白天的動(dòng)作電位發(fā)放的頻率（5.36±0.09，n=21）明顯高于夜間動(dòng)作電位發(fā)放的頻率（1.86±0.05，n=23；P＜0.01）；同時(shí)，非LTS特性神經(jīng)元白天動(dòng)作電位發(fā)放的頻率（8.08±1.85，n=9）也高于夜間動(dòng)作電位發(fā)放的頻率（1.16±0.58，n=6；P＜0.05）。

3 討論

早在1930年，Economo［5］就發(fā)現(xiàn)損毀下丘腦后部會(huì)引起睡眠量的增加，這一現(xiàn)象提示下丘腦后部有參與覺醒調(diào)控的機(jī)制。與此相類似，臨床檢查顯示一些失眠癥患者的下丘腦前部與基底前腦都有不同程度的損傷，這一現(xiàn)象表明，下丘腦前部與基底前腦存在促睡眠機(jī)制。這些猜想在隨后的研究中都得到了大力的證實(shí)［6］。目前，基與“蹺蹺板”假說(shuō)［7］是睡眠-覺醒發(fā)生機(jī)制假說(shuō)中較為主流的假說(shuō)之一，該假說(shuō)認(rèn)為大腦中存在有促睡眠腦區(qū)和促覺醒腦區(qū)，并且這兩種腦區(qū)有相互抑制的作用，實(shí)現(xiàn)睡眠與覺醒的快速轉(zhuǎn)換，以減少中間狀態(tài)存在的概率。“蹺蹺板”模型的一端是與覺醒相關(guān)的腦區(qū)，包括藍(lán)斑、基底前腦［8］、腹側(cè)髓質(zhì)［9］、中縫核、視結(jié)節(jié)乳頭，另外一端是與睡眠相關(guān)的腦區(qū)VLPO。Gallopin et al［3］研究表明，本實(shí)驗(yàn)中所記錄到的去甲腎上腺素抑制的、有LTS特性的神經(jīng)元就是促睡眠神經(jīng)元，這類神經(jīng)元有LTS特性的原因與鈣離子通道有關(guān)，而與鈉離子通道無(wú)關(guān)，然而并沒(méi)有證據(jù)可以證明此類具有LTS特性的神經(jīng)元會(huì)激發(fā)神經(jīng)元本身的某種固有的節(jié)律。早在19世紀(jì)40年代中期，研究者就用3種行為特征定義了動(dòng)物的睡眠，即對(duì)外界環(huán)境刺激響應(yīng)的減少，對(duì)強(qiáng)烈刺激的快速響應(yīng)，以及覺醒閾值的增加。促睡眠神經(jīng)元之所以有LTS的電特性，從生理功能上來(lái)說(shuō)可能是有助于神經(jīng)元對(duì)外界刺激作出快速響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)睡眠與覺醒的快速切換。

鼠類是夜行性動(dòng)物，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示促睡眠神經(jīng)元在小鼠覺醒時(shí)（晚間）的發(fā)放頻率明顯低于睡眠時(shí)（白天）的發(fā)放頻率，這與相關(guān)研究［3］一致，表明VLPO中促睡眠神經(jīng)元的活躍程度與其覺醒-睡眠功能活動(dòng)相一致。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示VLPO中非LTS特性神經(jīng)元的發(fā)放頻率也呈現(xiàn)出覺醒時(shí)低、睡眠時(shí)高的現(xiàn)象，提示VLPO區(qū)域其他神經(jīng)元可能也參與了小鼠晝夜節(jié)律的調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)為研究VLPO的睡眠調(diào)控作用提供了新的思路。

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Identification of ventrolateral preoptic nucleus and their different firing rate within day and night

Ding Zhengxia1，Xue Tian2，Bao Jin2，et al
（1Dept of Physiology，School of Basic Medical Science，Anhui Medical Univesity，Hefei 230032；
2CAS Key Laboratory of Brain Function and Disease，School of Life Science，
University of Science and Technology of China，Hefei 230027）

Objective To identificate the types of ventrolateral preoptic nucleus（VLPO）and recorde the action potential（AP）of this neurons within day and night for investigating their firing roles during day and light.MethodsThe fresh slices were made from WT mice aged 4～6 weeks，and the neurons were identified by their shape，different reaction to noradrenaline（NA）and electrical characteristics.AP firings of neurons were recorded during 11：00 ～16：00 and 22：00～02：00 with patch-clamp recording.The firing rates of these neurons were analyzed using t-test. Results The neurons in VLPO were successfully identified into two types.One type neurons with triangular and multipolar shape could be hyperpolarized by NA and had the electrical property of low-threshold spike（LTS）.The other type neurons with fusiform and bipolar shape could be depolarized by NA and lacked the electrical property of LTS（non-LTS）.Of 59 recorded neurons in VLPO，44 neurons had the character of LTS，and 15 neurons were non-LTS.Using t-test of statistics，AP firing rate of LTS neurons which were hyperpolarized by NA showed higher at day time than that at night（P＜0.01）.Non-LTS neurons which were depolarized by NA showed the similar tendency，that AP firing rate at day time was higher than that at night（P＜0.05）.Conclusion There are two types of neurons in VLPO.Both of them show high firing rate at day time and low firing rate at night time，which indicates they participate in regulating circadian rhythem.

ventrolateral preoptic nucleus；action potential；LTS；non-LTS

R 338.6

A

1000-1492（2016）09-1235-04

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.002.html

2016-04-14接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81571293、81371066、31322024）；中國(guó)科學(xué)院腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號(hào)：2013-1）

1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，合肥 2300322中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院腦功能與腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230027

丁正霞，女，碩士研究生；王烈成，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangliecheng@ahmu.edu.cn