甘蔗梢腐病原菌分離純化與ITS序列鑒定

何姍珊，方位寬，經 艷，譚 芳，韋永定，韋士評，梁朝旭，李 鳴

（1.廣西農業科學院甘蔗研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農業科學院，廣西 南寧 530007；3.廣西武宣種畜場，來賓 武宣 545900）

甘蔗梢腐病原菌分離純化與ITS序列鑒定

何姍珊1，方位寬2，經 艷1，譚 芳1，韋永定3，韋士評3，梁朝旭1，李 鳴1

（1.廣西農業科學院甘蔗研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農業科學院，廣西 南寧 530007；3.廣西武宣種畜場，來賓 武宣 545900）

采集甘蔗梢腐病發病植株葉片為材料，采用組織分離法，分別取發病甘蔗葉片和葉片的病健交接處，用PDA培養基對甘蔗梢腐病病原菌進行分離和純化，將純化后的菌株進行形態學和顯微鏡觀察，采用CTAB法提取菌絲DNA，利用2對真菌ITS通用引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后，回收特異條帶，T克隆測序。結果表明，甘蔗梢腐病原菌ITS序列與鐮刀菌屬ITS序列高度同源，屬于鐮刀菌屬。

甘蔗梢腐病；病原菌分離純化；ITS序列鑒定

甘蔗梢腐病是一種由鐮刀菌（Gibberella fujikuroi（Saw.）Wolle.，無性階段為Fusarium moniliforme Sheldon），有性態為串珠赤霉菌（Gibberella moniliforme Wineland）引起的，是甘蔗生產中常見的一種真菌性病害（Martin JP，et al.，1984；Raid RN，et al.1991，2002）。甘蔗梢腐病主要發生在高溫高濕、甘蔗生長最旺盛的6～9月份，也常發生在干旱后遇到降雨、干旱后充分灌水或施用氮肥過多等環境下。甘蔗梢腐病病原菌為鐮刀菌，主要危害蔗莖的梢部和葉片，感病后引起腐爛，故名梢腐病。帶病甘蔗種苗是甘蔗梢腐病的初次侵染來源，分生孢子隨風雨傳播，降落在梢頭心葉上，依靠心葉水分萌芽侵入。被害心葉呈梯形凸凹捻曲，并有縱裂，梢頭部的葉片常扭纏在一起變形，有明顯褐色皺紋。生長點受害時，引起甘蔗頂端腐爛和幼軸壞死，甚至腐爛發出惡臭，致使甘蔗莖整株干死。患病部位呈褐色，上方偶有淡桃紅色或淡黃色的粉霉狀物，時而伴有黑色小點。該病于1921年印度尼西亞爪哇首次報道，目前幾乎遍及所有甘蔗生產國和地區，并引起比較嚴重的病害，造成一定的損失（張國棉，2009）。早在1989年，廣東省珠江三角洲蔗區梢腐病突然爆發，造成POJ2878品種10%～38%的甘蔗莖枯死（黃鴻能，1993）。目前，甘蔗梢腐病在我國南方如廣西、廣東、福建、臺灣、云南和海南等甘蔗生產區都普遍發生。王伯輝報道，2005年廣西部分蔗田甘蔗梢腐病發生較重，特別是新臺糖23、新臺糖25和新臺糖26品種，病株率高達70%～80%（王伯輝，2007）。韋金菊等報道，2010年廣西主蔗區如柳州、隆安和北海等地甘蔗梢腐病發病率在25%以上，最高達40%。隨著新臺糖22等易感病甘蔗品種的引進和大面積推廣種植，甘蔗梢腐病發生呈逐漸加重的趨勢，已經成為甘蔗生長前中期的主要病害（韋金菊，2012）。

近些年來，有關甘蔗梢腐病的研究，國外大多聚焦于病原菌Gibberella fujikuroi及其無性態串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme Sheldon的分類學、種系發育，以及代謝產物等方面進行（Hanson J.R，1996；Bacon，C.W，1996；Emma T，4000）。由于我國對甘蔗病害的基礎性研究比較薄弱，與先進國家相比有較大差距，關于甘蔗病害研究還停留在甘蔗梢腐病的發生和防治（黃鴻能，1990；劉夢林，1991；馮奕璽，2002；盧昌，2002；盧文潔，2007；李釗，2013）。由于傳統真菌的分類、鑒定主要是基于營養體和子實體的形態學特征并結合其生理生化性狀的描述。由于真菌形態特征易受培養條件和其他因素影響，且許多子實體類型很難獲得，傳統分類方法無法滿足準確鑒定和分類要求。近年來，由于真菌核糖體基因轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列能夠反映出屬間、種間以及菌株間堿基對差異，已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統發育研究。本文除了對純化菌株進行形態學和顯微鏡觀察外，還利用分子技術在DNA水平對其進行ITS鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

試驗材料采集于廣西農業科學院甘蔗研究所田間實驗，實驗材料為桂糖43號。利用組織分離法，分別取患有梢腐病甘蔗植株的病葉葉片，沖洗干凈后，在葉片病健交界處，切下5mm×5mm的小塊，用濃度為0.1%的升汞溶液消毒3min，75%乙醇溶液浸泡1min，用無菌水沖洗3次，在超凈工作臺吹干后轉入PDA平板培養基上（取土豆200g，洗干凈，去皮后切成小塊，加水1000 mL煮沸25 min，用紗布過濾，加水將濾液補充至1000 mL，加入20g葡萄糖和20g瓊脂，加熱充分溶解即可），25℃恒溫培養，待長出菌絲后，在菌落邊緣用無菌接種針挑取小塊帶有菌絲的培養基，轉移至新PDA培養基，25℃恒溫培養。反復多次培養、挑菌、轉移至新PDA培養基，直至無雜菌出現。

1.1.2 引物選擇

利用2對真菌ITS通用引物ITS1（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），ITS3（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌絲DNA提取

挑取菌絲，轉移至PDA培養基，25℃恒溫培養箱中培養，待菌落覆蓋培養皿80%左右時刮下菌絲置于2ml離心管中，參照上海生工真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取菌絲DNA。

1.2.2 ITS特異性擴增和序列分析

分別用真菌ITS通用引物對菌絲DNA進行PCR擴增：ITS1（5’-GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG-3’）和ITS2（5’-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3’），ITS3（5’-TCCGTAGGTGAACCTCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGC TT ATTGATATGC-3’），以菌絲DNA為模板，用引物ITS1和ITS2進行PCR擴增，反應體系為：10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol/LdNTPs Mixture 0.5μL，MAP1和MAP2引物（10μmol/L）各1.0μL，ddH2O 19.3μL，cDNA模板0.5μL，總體積25.0μL。反應程序為：95℃預變性3 min；95℃120 s，54℃30 s，72℃1 min，進行35個循環，72℃5min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根司）回收目的片段，回收產物連接T載體，反應體系為：5.0μL SolutionⅠ，4.5μL模板，0.5μL pMD18-T載體，16℃保溫2.5 h。連接產物轉化大腸桿菌（E.coli）DH5α感受態細胞，37℃過夜培養，篩選陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 形態和顯微鏡觀察

在PDA培養基上，菌落呈放射式，白色絨毛狀（如圖1），菌絲生長速度緩慢，7d左右長滿培養皿，取菌絲在顯微鏡下觀察，發現有大小兩種分生孢子，大分生孢子呈鐮刀形，也有蓮藕狀，有多個黑色小顆粒（圖2）；小分生孢子，呈半月形，紡錘形，且在兩端各有1個黑色小顆粒（圖3）。

2.2 PCR擴增和ITS序列分析

圖1 在PDA培養基上的菌絲

圖2 顯微鏡下大分生孢子形態

圖3 顯微鏡下小分生孢子形態

圖4 PCR擴增ITS電泳結果M：DNA marker

由圖4可知，1%瓊脂糖凝膠電泳表明，PCR擴增產物具有很高的特異性，且產物片段大小在500-750bp之間，與預期結果一致。T-克隆送上海生個測序，獲得一條長度為493bp的序列如下：

CCCTGTGACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGA TCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCC AGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTT CTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAA CAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA CGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCA GAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAT TGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTT CGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTT GGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGC CGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGC TTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGT ACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTT CTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCG CTGAACTTAAGCATATC

將上述序列在NCBI中進行Blast比對，結果發現該序列與鐮刀菌屬呈100%的同源性（如圖5）。由此表明，實驗分離和純化得到的菌絲屬于鐮刀菌屬。

圖5 序列在NCBI blast比對結果

3 結論和討論

本試驗采用組織分離法對甘蔗梢腐病病原菌進行分離、純化，實驗表明甘蔗梢腐病可以利用PDA培養基，從患有梢腐病甘蔗植株的病葉葉片快速獲得，且純化后的菌絲長勢好，在25℃下生長速度快，并且污染率很低，這有可能與樣品用0.1%升汞3min浸泡時間分不開，75%乙醇浸泡后，用無菌水多次沖洗后，一定置于超凈工作臺吹干樣品，有利于減少污染。試驗使用的PDA培養基不需要添加其他營養成分，培養基含有菌絲生長所需的營養物資和微量元素，完全滿足菌絲分離和生長速度。

本試驗關于菌種鑒定采用ITS法，其準確性高且簡單易行。通過對菌絲體的ITS區段長度進行比對，驗證了供試菌絲體屬于鐮刀菌屬，為進一步研究甘蔗梢腐病提供了科學依據。

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S566.108

B

2095-820X（2016）04-05

2016-06-29

國家自然基金（31460093，31400281）；廣西科學研究與技術開發項目（桂科重14121005-1-2，桂科攻1598006-1-1D）。

何姍珊（1981-），女，甘肅金昌人，大學本科，主要從事甘蔗育種研究，email：shanbh613@126.com。

簡介：李鳴（1977-），博士，副研究員，主要從事甘蔗育種研究工作，email：gxua9606@163.com；梁朝旭（1972-），碩士，副研究員，主要從事甘蔗育種工作，email：nnlzx@126.com。