大鼠腎缺血再灌注損傷模型心肌內過氧化酶Ⅲ的表達變化

霍宏昌，王　切，王素玲，王　磊*

(1.河北省石家莊市婦幼保健院外科，河北 石家莊 050081；2.河北醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗科；河北 石家莊 050071)

?

大鼠腎缺血再灌注損傷模型心肌內過氧化酶Ⅲ的表達變化

霍宏昌1，王切2，王素玲3，王磊2*

(1.河北省石家莊市婦幼保健院外科，河北 石家莊 050081；2.河北醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，河北 石家莊 050017；3.河北省血液中心檢驗科；河北 石家莊 050071)

目的觀察過氧化酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ，PrxⅢ)在大鼠腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)模型心肌內的表達變化，探討PrxⅢ在抗氧化應激反應中的作用。方法大鼠切除右腎后，無損傷動脈夾夾閉左腎動脈，建立腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24 h后取材(血、腎、心)。采用酶偶聯速率法和苦味酸法檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(seaum creatinine,SCr)濃度；HE染色法觀察大鼠腎組織形態；硫代巴比妥酸比色法(thiobarbituric acid,TBA)檢測心肌丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量；應用逆轉錄聚合酶鏈反應法和免疫印跡法測定大鼠心肌組織內抗氧化酶PrxⅢ的mRNA與蛋白表達水平。結果RIRI組大鼠血清中BUN和SCr濃度明顯高于對照組，RIRI組大鼠心肌組織中MDA含量、PrxⅢ mRNA水平相對表達量、PrxⅢ蛋白水平相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論RIRI后，心肌組織出現過氧化損傷；PrxⅢ在腎缺血再灌注損傷大鼠的心組織內發揮了抗氧化應激的作用。

再灌注損傷；腎;過氧化酶Ⅲ；大鼠doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.013

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是泌尿外科臨床治療過程中經常發生的病理生理過程，也是導致患者術后發生急性腎衰竭和腎功能恢復延遲的重要因素[1-4]。當腎臟發生急性缺血再灌注時，會產生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，導致其處于高度的氧化應激狀態，這也是缺血后再灌注時發生損傷的重要機制之一[5-7]。羥自由基(OH-)、超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)都是ROS的重要成員，它們可以破壞細胞內的蛋白質、脂類和DNA等生物大分子，從而影響細胞的功能，導致細胞的損傷甚至死亡[8-10]。研究發現，當腎功能受損時，其遠端或鄰近器官如肝、肺、心、腦和腸等的功能也會同時受損[11]。過氧化酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ, PrxⅢ)屬能清除ROS的過氧化物酶系[12]，也是整個家族中唯一特異性定位于線粒體內的成員。線粒體是內源性ROS的主要產生來源，同時它自身也遭受ROS的攻擊。已有研究發現，細胞線粒體內H2O2的清除與PrxⅢ具有密切關系[13-14]。心是機體內需氧量大、容易受到ROS攻擊、遭受過氧化損傷的器官。在RIRI時，腎臟處于高度氧化應激狀態；心臟是否也會發生過氧化損傷，心肌組織PrxⅢ的表達如何變化，尚未見相關報道。本研究觀察大鼠RIRI模型心肌內的PrxⅢ表達變化，旨在探討PrxⅢ在抗氧化應激反應中的作用，現報告如下。

1　材料與方法

1.1RIRI模型建立及樣品處理選用健康成年雄性Wistar大鼠12只，體質量190～210 g，隨機分為RIRI組和對照組各6只。6%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉下，將大鼠固定于手術臺上，常規備皮、消毒、鋪單。自劍突向下做腹部正中切口4 cm，結扎右側腎蒂后切除右腎。RIRI組大鼠分離左腎動脈,用無創動脈夾將其夾閉, 觀察左腎顏色，由鮮紅漸變為暗紅，顯示夾閉成功。45 min后松開動脈夾,恢復血供,可見左腎動脈充盈, 顏色迅速轉為鮮紅色,顯示再灌注成功。對照組大鼠只分離左腎動脈并不夾閉。術后單籠飼養，自由飲食飲水。

術后24 h再次麻醉大鼠，自頸總動脈取血約5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清去除紅細胞，用于血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(seaum creatinine, SCr)濃度測定；取腎并用4%多聚甲醛浸泡固定，組織切片HE染色光鏡觀察其形態學變化；取心肌組織置于液氮中，用于丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和PrxⅢ mRNA及蛋白水平測定。

1.2主要試劑Trizol、Taq DNA聚合酶等均為Invitrogen公司產品；溴化乙啶、瓊脂糖、RT試劑盒為Promega公司產品；PrxⅢ一抗(兔抗鼠)Abcam公司，二抗(羊抗兔)Zymed公司。血清SCr和BUN測定試劑盒，均為中生北控生物科技股份有限公司產品；MDA測定試劑盒為南京建成科技有限公司產品。

1.3血清SCr和BUN濃度測定根據試劑盒說明書，采用苦味酸法測定血清樣本SCr濃度，酶偶聯速率法測定BUN濃度。將R1和 R2按照1∶1的比例混合成工作液，校準品開瓶即可使用，用于測定SCr濃度；用R2溶解R1，溶解后即為工作液，校準品為廠家提供，用于測定BUN濃度。各取3只直徑為1 cm的比色管，分別作為空白管、校準管和樣本管。在空白管內加入1 mL工作液和0.1 mL生理鹽水，在校準管內加入1 mL工作液和0.1 mL校準品，在樣本管內加入1 mL工作液和0.1 mL血清樣本，分別混勻待檢測。測定其在波長505 nm(SCr)和340 nm(BUN)、溫度37 ℃條件下的吸光度值。混勻后30 s所測吸光度值為A1，再過20～60 s所測吸光度值為A2，用2次吸光度的差值，以空白管調零，計算吸光度變化值，即△A樣本和△A校準。根據公式C樣本=△A樣本×C校準/△A校準，計算每個血清樣本的SCr和BUN濃度。

1.4腎組織形態學觀察采用HE染色法觀察大鼠腎組織的形態結構。取腎組織，按常規組織切片制作步驟進行操作：脫水、透明、浸蠟、包埋，切片厚約5 μm，HE染色后封片，用奧林巴斯光學顯微鏡，觀察腎組織的形態變化并拍攝照片。

1.5心肌組織中MDA含量的測定將心肌組織按照20 mg/100 μL的標準加入預冷的勻漿緩沖液(1 mmol/L鹽酸苯甲脒，pH 7.4，0.1%吐溫-20，50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，5 mmol/L β-巰基乙醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L 乙二胺四乙酸三鈉鹽，0.5 mol/L NaCl)，在冰浴中勻漿，條件為：4 ℃、4 000 r/min(約3 500 g)，離心20 min，取上清制成含10%心肌組織的勻漿液，按照試劑盒操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法(thiobarbituric acid,TBA)測定心肌MDA含量。

1.6心肌組織PrxⅢ mRNA水平相對表達量的測定采用Trizol(Invitrogen公司)法提取心組織總RNA。用3 μg RNA反轉錄生成cDNA，GAPDH作為內參照，進行逆轉錄聚合酶鏈反應。用PrxⅢ與內參的擴增產物灰度值之比，表示PrxⅢ mRNA相對表達量。所用PrxⅢ、GAPDH引物序列見表1。

表1　PrxⅢ和GAPDH引物序列Table 1　The primers of PrxⅢ and GAPDH

1.7心肌組織PrxⅢ 蛋白水平相對表達量的測定采用免疫印跡分析法，測定大鼠心肌組織內PrxⅢ蛋白的相對表達量。將心肌組織制成勻漿后，離心取上清。采用改良Lowry法測定心肌組織蛋白總量。電泳時上樣量為62 μg。經電泳、轉膜、封閉后，在聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上滴加一抗，室溫(18～24 ℃)過夜，漂洗后加HRP標記的二抗。按照發光試劑的操作說明進行顯影、定影、晾干。影像掃描后進行數據分析(以條帶吸光度值與內參之比表示相對表達量)。

2　結　　果

2.1大鼠腎組織形態學改變光鏡觀察結果顯示：對照組大鼠腎小囊、腎血管球、集合管、遠曲小管及近曲小管形態結構清晰規整；RIRI組大鼠腎小管管腔擴張明顯，腎小囊囊腔擴張，部分腎小球萎縮、體積變小，腎小管間隙擴大，腎間質水腫，集合管管腔擴張等改變(圖1)。

圖1大鼠腎小球、腎小管形態結構(HE×400)

A.對照組;B.RIRI組

Figure1Morphologyofglomeruliandtubules(HE×400)

2.22組觀察指標比較RIRI組大鼠血清BUN和SCr濃度明顯高于對照組，RIRI組大鼠心肌組織中MDA含量、PrxⅢmRNA水平相對表達量、PrxⅢ蛋白水平相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2和圖 2，3。

表22組觀察指標比較

組別尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)MDA(mmol/g)PrxⅢmRNAPrxⅢ蛋白對照組4.462±0.541103.444±8.46510.18±1.770.95±0.170.58±0.09RIRI組13.685±4.397131.153±17.81414.01±2.291.34±0.181.01±0.17t5.0933.4593.2403.8985.367P0.0000.0060.0090.0030.000

圖2心肌組織PrxⅢ mRNA相對表達量

Figure 1The mRNA expression of PrxⅢ in heart

圖3心肌組織PrxⅢ蛋白相對表達量

Figure 2The protein expression of PrxⅢ in heart

3　討　　論

腎是機體內重要的排泄和分泌器官，對于維持機體內環境的相對穩定具有重要意義。當腎功能受損時，機體其他主要臟器肝、肺、心、腦、腸等的功能也會同時受損，但機制尚不十分清楚。RIRI是臨床治療過程中一種常見的病理生理反應，多見于腎擠壓傷、腎移植、部分腎切除及失血性休克等的臨床治療過程中。RIRI也是導致患者出現術后并發癥如急性腎衰竭、腎移植失敗的重要原因之一[1-5]。已有研究證實，氧化應激是導致RIRI的重要機制之一[5-7]。本研究的目的是觀察RIRI后心肌組織內MDA含量和PrxⅢ表達水平的改變。探討RIRI后心肌組織損傷的可能原因以及抗氧化酶PrxⅢ在此過程中的抗氧化作用，為防治RIRI所誘發的心肌組織損傷提供數據參考和理論依據。本研究首先建立大鼠RIRI的模型：第一步切除大鼠右腎，第二步分離大鼠左腎動脈，然后用無損傷動脈夾夾閉，第三步夾閉45 min后去掉動脈夾，恢復大鼠左腎的血液供應，制造大鼠RIRI模型；左腎恢復血液供應24 h后取材，左腎組織光鏡觀察顯示RIRI組大鼠的腎小球以及腎小管均已發生明顯的形態學改變。臨床上常用的檢測腎功能的指標是SCr和BUN。當腎功能受損時腎小球濾過率會降低，血清內BUN和SCr的濃度也會隨之升高。本研究結果顯示RIRI組大鼠血清BUN和SCr濃度明顯高于對照組。表明RIRI組大鼠的腎功能已經受損，大鼠RIRI模型是成功的。

大鼠RIRI后，心肌組織是否發生過氧化損傷？通過檢測心肌組織內MDA的含量，用MDA的含量反映心肌組織是否遭受過氧化損傷。MDA 是ROS與組織脂類物質(細胞膜等)發生過氧化反應所形成的，是最重要的脂類物質過氧化產物之一，其含量反映了組織內脂質過氧化的強度和速度，常被作為評價細胞或組織發生過氧化損傷后損傷程度的客觀指標[15]。本研究結果顯示RIRI組心肌組織內MDA含量明顯高于對照組。推測在RIRI發生后，大鼠心肌組織遭受ROS的攻擊，并與心肌組織的脂類物質發生過氧化反應，導致脂類過氧化產物的大量堆積。表明當RIRI發生后心肌組織也遭受過氧化損傷。

PrxⅢ在心肌細胞的線粒體內大量表達。已有研究證實，PrxⅢ能清除心肌細胞線粒體內產生的大量ROS，保護心肌組織免受過氧化損傷[13-14]。本研究結果顯示RIRI組大鼠心肌組織內PrxⅢ的mRNA水平和蛋白水平明顯高于對照組。考慮心肌組織內MDA的含量升高，再結合PrxⅢ的mRNA和蛋白水平的升高，推測當RIRI發生后，不僅腎臟內有大量ROS，而且心肌組織內的ROS含量也隨之增多。過多的ROS與脂質發生過氧化反應，導致MDA等過氧化產物的大量堆積。為了清除過多的ROS，機體通過上調PrxⅢ的含量清除過多的ROS，以保護心肌組織免遭過氧化損傷。

綜上所述，在RIRI時，心肌組織也發生過氧化損傷，抗氧化酶PrxⅢ可能在清除ROS、減輕心肌組織的氧化應激中發揮重要作用。這為防治RIRI所誘發的心肌損傷提供了一條新思路。

[1]孟彥麗，王切，王素玲，等.PrxⅤ和CAT在大鼠腎缺血再灌注損傷模型的表達變化[J].河北醫科大學學報，2013,34(5)：508-511.

[2]Ye Q,Zhu YI,Ye S,et al. Gypenoside attenuates renal ischemia/reperfusion injury in mice by inhibition of ERK signaling[J]. Exp Ther Med,2016,11(4):1499-1505.

[3]Zhou M,Tang W,Fu Y,et al.Progranulin protects against renal ischemia/reper-fusion injury in mice[J]. Kidney Int,2015,87(5):918-929.

[4]Menke J,Sollinger D,Schamberger B,et al. The effect of ischemia/reperfusion on the kidney graft[J]. Curr Opin Organ Transplant,2014,19(4):395-400.

[5]Aksu U,Ergin B,Bezemer R,et al. Scavenging reactive oxygen species using tempol in the acute phase of renal ischemia reperfusion and its effects on kidney oxygenation and nitric oxide levels[J]. Intensive Care Med Exp,2015,3(1):57.

[6]Lee D,Park S,Bae S,et al. Hydrogen peroxide-activatable antioxidant prodrug as a targeted therapeutic agent for ischemia reperfusion injury [J]. Sci Rep,2015,5:16592.

[7]Malek M,Nematbakhsh M. Renal ischemia/reperfusion injury; from pathophysiology to treatment [J]. J Renal Inj Prev,2015,4(2):20-27.

[8]Lee D,Bae S,Hong D,et al. H2O2 responsive molecularly engineered polymer nanoparticles as ischemia/reperfusion-targeted nanotherapeutic agents [J]. Sci Rep，2013,3:2233.

[10]Wang L,Duan Q,Wang T,et al. Mitochondrial respiratory chain inhibitors involved in ROS production induced by acute high concentrations of iodide and the effects of SOD as a protective factor[J]. Oxid Med Cell Longev，2015,2015: 217670.

[11]Fatemikia H,Ketabchi F,Karimi Z,et al. Distant effects of unilateral renal ischemia/reperfusion on contralateral kidney but not lung in rats: the roles of ROS and iNOS[J]. Can J Physiol Pharmacol，2015,94(5):477-487.

[12]Peroja P,Haapasaari KM,Mannisto S,et al. Total peroxiredoxin expression is associated with survival in patients with follicular lymphoma [J]. Virchows Arch，2016,468(5):623-630.

[13]Toledano MB,Delaunay-Moisan A. Keeping oxidative metabolism on time:mitochondria as an autonomous redox pacemaker animated by H2O2and peroxiredoxin[J]. Mol Cell,2015,59(4):517-519.

[14]Kil IS,Ryu KW,Lee SK,et al. Circadian oscillation of sulfiredoxin in the mitochondria[J]. Mol Cell，2015,59(4):651-663.

[15]牛林紅，董會臺，楊麗莉,等.不同粒徑納米二氧化鈦對小鼠抗氧化能力的損傷作用[J].河北醫科大學學報，2015,36(2)：184-187.

(本文編輯：趙麗潔)

Expression changes of peroxiredoxin Ⅲ in the myocardium of renal ischemia reperfusion injury model in rats

HUO Hong-chang1, WANG Qie2, WANG Su-ling3, WANG Lei2*

(1.Department of Surgery，Maternal and Child Health Care Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Prvoince，Shijiazhuang 050081，China; 2.Department of Anatomy, School of Basic Medical Sciences,Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China；3.Department of Laboratory,the Blood Center of Hebei Province, Shijiazhuang 050071, China)

ObjectiveTo observe the expression of peroxiredoxin Ⅲ(PrxⅢ) in renal ischemia reperfusion injury model rats and study the role in oxidative stress response. MethodsAfter removal of the right kidney, the left renal artery without injury was removed, and the model of renal ischemia and reperfusion injury was established. After 24 hours of reperfusion, the blood and kidney were taken. The serum blood urea nitrogen(BUN) and serum creatinine(SCr) were detected with picric acid method and enzyme coupling rate method, the malondialdehyde(MDA) content in myocardial tissue was determined by thiobarbituric acid colorimetric method. The renal morphology change was observed by HE staining. The PrxⅢ mRNA and protein expression in myocardium were evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blot. ResultsCompared with the control group, the BUN and SCr in serum of renal ischemia reperfusion injury group were significantly increased. The MDA content, the PrxⅢ mRNA relative expression level and protein relative expression level in myocardium of renal ischemia reperfusion injury group were higher than that of control group, there were statistically significant difference (P<0.05). ConclusionAfter renal ischemia reperfusion injury, myocardial tissue appeared oxidative damage. PrxⅢ plays a role of anti oxidative stress in the heart tissue of rats with renal ischemia reperfusion injury.

reperfusion injury; kidney; peroxiredoxin Ⅲ; rats

R619.9

A

1007-3205(2016)10-1165-05