含有甘氨酸和L-脯氨酸多肽的轉角結構研究

張 勇，孫艷美，原現瑞，楊毅華

(1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學重點實驗室，河北石家莊 050018；3.河北科技大學河北省分析測試研究中心，河北石家莊 050018)

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含有甘氨酸和L-脯氨酸多肽的轉角結構研究

張 勇1,2，孫艷美1，原現瑞3，楊毅華1,2

(1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學重點實驗室，河北石家莊 050018；3.河北科技大學河北省分析測試研究中心，河北石家莊 050018)

肽鏈轉角結構的形成與其結構中分子內氫鍵的存在有著直接關系，可通過檢測肽鏈中分子內氫鍵的存在情況對肽鏈轉角結構進行研究。為了深入研究具有轉角結構的肽類化合物，以甘氨酸、L-脯氨酸為原料，叔丁氧羰基和苯胺為封端基團，在HBTU，HATU縮合劑的作用下制備了2種三肽和3種四肽。通過1H NMR，IR及MS對合成產物進行結構表征，用核磁共振等梯度變溫氫譜實驗對合成的多肽分子內氫鍵進行檢測，用1H-1H NOE對形成的分子內氫鍵的羰基位置進行推測。實驗表明：在合成的5種多肽中，有3種多肽形成了分子內氫鍵，2種未形成。在形成分子內氫鍵的多肽中都有-Gly-L-Pro-Gly-片段，而只有-L-Pro-Gly-或-Gly-L-Pro-片段的多肽未形成分子內氫鍵；形成分子內氫鍵的羰基位置為與苯胺氮氫相連的羰基，形成分子內氫鍵的氮氫位置為與叔丁氧羰基相連的氮氫。

生物有機化學；轉角結構；分子內氫鍵；核磁共振光譜；-Gly-L-Pro-Gly-片段；多肽

肽鏈的轉角結構是蛋白質的一種二級結構[1-3]，是通過自身骨架結構中的羰基和酰胺基團之間的分子內氫鍵形成的，氫鍵是肽鏈轉角結構穩定的主要作用力[1]。蛋白質的轉角結構可分為γ，β，α和π-轉角結構，分別由3，4，5和6個氨基酸通過分子內的氫鍵而形成[4]。其中，β-轉角結構肽鏈中出現一種180°的轉折，是最常見的、數量最大的轉角結構[2]。在轉角結構中，甘氨酸和L-脯氨酸出現的概率很大，L-脯氨酸為轉角結構提供所必需的順勢構象。

具有轉角結構的肽類化合物正逐漸成為開發新型藥物先導化合物的一個新來源。直鏈肽分子的結構在體內易受到各種蛋白酶的作用而分解失活[5-9]。肽類激素與G蛋白偶聯受體(GPCRs)間相互作用的構效關系研究表明，受體能夠識別并結合具有β-轉角結構的內源性肽，以及經過修飾的β-轉角結構肽鏈片段[10-11]。內源性肽構象柔軟，可以結合在G蛋白偶聯受體的不同位點，同時又受蛋白酶水解的影響較大，而β-轉角構象模擬物構象剛性大，相對于內源性肽有很大優勢。因此基于具有“回轉”結構的藥效基團的藥物化學研究成為一個很受關注的領域[12-18]。

筆者設計了含有甘氨酸和L-脯氨酸的5種多肽鏈，分別為N-叔丁氧羰基-甘氨酸-L-脯氨酸-甘氨酸-苯胺三肽(化合物1)，N-叔丁氧羰基-甘氨酸-甘氨酸-L-脯氨酸-甘氨酸-苯胺四肽(化合物2)，N-叔丁氧羰基-甘氨酸-L-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯胺四肽(化合物3)，N-叔丁氧羰基-L-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯胺四肽(化合物4)，N-叔丁氧羰基-甘氨酸-甘氨酸-L-脯氨酸-苯胺三肽(化合物5)，多肽分子的結構如圖1所示。采用核磁共振光譜和質譜對其進行了結構表征，通過核磁共振等梯度變溫氫譜實驗對其進行了分子內氫鍵檢測，從中篩選出3種含有轉角構象的化合物,對具有轉角結構的多肽進行了構效關系研究，為相關研究提供新思路和新方法。

圖1 多肽分子結構Fig.1 Structures of peptides

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

SGWX-4 顯微熔點儀(上海精密科學儀器有限公司提供)；Bruker AVANCE Ⅱ 500 MHz 核磁共振儀(瑞士 Bruker Boispin 公司提供)；LC-MS2010EV 液相色譜質譜聯用儀(日本島津公司提供)；ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠提供)。

HBTU(Shanghai Medpep Co., Ltd提供)；HATU(Shanghai Medpep Co., Ltd提供)；N,N-二異丙基乙胺(Shanghai Medpep Co., Ltd提供)；CDCl3(Cambridge Isotope Laboratories. Inc提供)；二氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司提供)；N,N-二甲基甲酰胺(國藥集團化學試劑有限公司提供)等。

1.2 多肽鏈的合成

合成多肽片段的方法采用碳端到氮端的液相逐一合成法[19-21]，5種多肽鏈的合成方法類似，以合成化合物1闡述多肽鏈的合成過程。

在裝有滴液漏斗、溫度計和回流冷凝管并附帶氯化鈣干燥管的250 mL四口燒瓶中，加入1 mol/mL氫氧化鈉水溶液110 mL，加入天然氨基酸0.1 mol；將22.3 g (0.1 mol) 二碳酸二叔丁酯溶解到75 mL叔丁醇中，使其在1 h內滴加完畢，室溫下將反應液攪拌過夜。后處理方法為用正己烷(30 mL)萃取，保留水相；再置于0～5 ℃的冰水浴中，向水相中滴加飽和硫酸氫鉀水溶液，攪拌，調節pH值為1～1.5，用乙酸乙酯(100 mL×4)萃取。用薄層色譜檢測有機相，展開劑石油醚與乙酸乙酯體積比為2∶1(加入1滴冰乙酸)。將有機相用無水硫酸鎂干燥5 h，抽濾，將濾液濃縮，得到油狀透明液體，再加入適量正己烷，攪拌，冷卻，析出晶體，抽濾后得到白色產物N-叔丁氧羰基甘氨酸。

向500mL單口燒瓶中加入N-叔丁氧羰基甘氨酸1.75g(10mmol)，二氯甲烷250mL，N,N-二甲基甲酰胺25mL，苯胺1mL(11mmol)，HBTU4.3g(11mmol)，加入適量N,N-二異丙基乙胺，調節pH值為8～9，室溫下攪拌反應12h。將反應液濃縮，趁熱加入100mL水，有沉淀生成。用乙酸乙酯(100mL×4)萃取，合并有機相，依次用5%(質量分數，下同)碳酸鉀、2%(體積分數)鹽酸、水、飽和食鹽水溶液(100mL×3)進行洗滌，得到有機相。加入適量的無水硫酸鎂干燥過夜，過濾濃縮后得到固體產品N-叔丁氧羰基甘氨酸-苯胺。

向250mL單口燒瓶中加入N-叔丁氧羰基甘氨酸-苯胺2.5g(10mmol)、二氯甲烷15mL、三氟乙酸10mL，進行脫保護反應，攪拌2h，將反應液濃縮得到油狀液體。然后進行酰胺鍵的縮合反應，合成路線如圖2所示，將目標產物用柱層析或重結晶的方法進行純化。對合成的多肽化合物進行核磁共振、紅外光譜和高分辨質譜實驗，對其結構進行確定。

圖2 多肽化合物1的合成路線Fig.2 Synthetic route of peptide 1

1.3 分子內氫鍵的檢測

在稀溶液 (1～2 mmol/L) 中，分子間的氫鍵可以忽略，形成分子內氫鍵的酰胺質子具有較穩定的結構，受溫度的影響較小，有較低的溫度系數；而未形成分子內氫鍵的酰胺質子受溫度的影響較大，有較高的溫度系數[22]。因此本實驗采用核磁共振等梯度變溫氫譜實驗檢測多肽中分子內氫鍵的形成。用CDCl3作溶劑，將目標多肽片段配成2 mmol/L的稀溶液，進行1H NMR實驗。溫度變化范圍為24～48 ℃，溫度差為4 ℃。1H NMR實驗采用zg30脈沖序列測定，譜寬為16×10-6，數據點65 KB，弛豫延遲0 s，掃描次數64次，指數窗函數傅里葉變換，線寬因子0.3 Hz，TMS為內標校正化學位移。

1.4 核磁共振1H-1H NOE實驗

對形成分子內氫鍵的多肽進行核磁共振1H-1H NOE實驗，根據NOE譜圖中的相關峰推測出形成分子內氫鍵的羰基的位置，從而確定轉角結構。用CDCl3作溶劑，將目標多肽片段配成200 mmol/L的溶液，做核磁共振1H-1H NOE實驗，實驗溫度為25 ℃，NOE譜采用NOESYGPPH脈沖序列測定，F1和F2維譜寬都是11×10-6，數據點F1×F2=4 096×256，掃描次數為96次，弛豫延遲4 s。

2 結果與討論

2.1 多肽鏈的結構表征

2.1.1N-叔丁氧羰基-甘氨酸-L-脯氨酸-甘氨酸-苯胺三肽

2.1.2N-叔丁氧羰基-甘氨酸-甘氨酸-L-脯氨酸-甘氨酸-苯胺四肽

2.1.3 N-叔丁氧羰基-甘氨酸-L-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯胺四肽

2.1.4 N-叔丁氧羰基-L-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯胺四肽

2.1.5 N-叔丁氧羰基-甘氨酸-甘氨酸-L-脯氨酸-苯胺三肽

2.2 分子內氫鍵的檢測結果

等梯度變溫1HNMR的實驗結果表明：多肽化合物1中的2號N—H、化合物2中的2號N—H、化合物3中的2號N—H的化學位移溫度系數小于2.6×10-9/T，即形成了分子內氫鍵；多肽化合物4、化合物5中的N—H的化學位移溫度系數均大于2.6×10-9/T，即未形成分子內氫鍵。多肽分子內氫鍵檢測的實驗數據如表1所示，化合物1的1H NMR變溫實驗圖譜如圖3所示。

表1 多肽鏈分子內氫鍵檢測實驗數據

圖3 化合物1的1H NMR變溫實驗局部放大圖譜Fig.3 Part variable-temperature 1H NMR spectra of compound 1

2.3 核磁共振1H-1H NOE實驗結果

核磁共振1H-1H NOE實驗結果顯示，化合物1的叔丁氧基上的1H和苯環上15H，16H和17H有相關峰，與叔丁氧基相連的氨基上的2H與11H有相關峰，證明上述氫原子在立體空間里相接近，可推測2位氫原子和13位羰基的氧原子形成分子內氫鍵，其NOE局部放大圖如圖4所示。

同理，根據化合物2和化合物3的NOE實驗結果，可推測2位氫原子和15位羰基的氧原子形成了分子內氫鍵。

3 結 論

1)以甘氨酸、L-脯氨酸為原料，叔丁羰基和苯胺為封端基團，在HBTU和HATU縮合劑的作用下制備了2種三肽和3種四肽，通過1H NMR，IR及HRMS對合成產物進行了結構表征。

圖4 多肽化合物1的局部放大NOE圖譜Fig.4 Part NOE NMR spectra of peptide 1

2)采用核磁共振等梯度變溫氫譜實驗，對合成的5種多肽進行了分子內氫鍵的檢測，表明在合成的5種多肽中，有3種多肽形成了分子內氫鍵，2種未形成。在形成分子內氫鍵的多肽中都有-Gly-L-Pro-Gly-片段，而只有-L-Pro-Gly-或-Gly-L-Pro-片段的多肽未形成分子內氫鍵。

3)對形成分子內氫鍵的多肽結構表征證明，形成分子內氫鍵的氮氫位置為與叔丁氧羰基相連的氮氫，NOE實驗結果可推測羰基的位置為與苯胺氮氫相連的羰基。

4)由研究結果可知，L-脯氨酸可以提供轉角結構形成的順勢構象，-Gly-L-Pro-Gly-多肽鏈片段可形成轉角結構。

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Study on the turn structure of polypeptides containing glycine andL-proline

ZHANG Yong1,2， SUN Yanmei1， YUAN Xianrui3， YANG Yihua1,2

(1.School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang，Hebei 050018, China; 2.Hebei Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug, Shijiazhuang，Hebei 050018, China; 3. Analysis and Testing Center, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang，Hebei 050018，China)

The formation of turn structure in peptide chains has direct relations with intramolecular hydrogen bonds, therefore the existence of this bond can be tested to research the turn structure. Herein, two tripeptides and three tetrapeptides are synthesized by using glycine andL-proline as raw materials,t-butoxycarbonyl and aniline as capping groups, and HBTU and HATU as condensation reagents.1H NMR, IR and MS are adopted to characterize the structure of the products. Constant-gradient and variable-temperature1H NMR spectra test is used to detect the intramolecular hydrogen bond of the synthesized polypeptides, and1H-1H NOE is used for the speculation of the carbonyl group location of intramolecular hydrogen bond. The test illustrates that intramolecular hydrogen bond is found in three out of the five synthesized polypeptides, and it is not found in the other two. The polypeptides with intramolecular hydrogen bond formed all have the "-Gly-L-Pro-Gly-" segment, while the polypeptides with only "-L-Pro-Gly-" segment or "-Gly-L-Pro-" segment do not have intramolecular hydrogen bond formed. The carbonyl group forming of intramolecular hydrogen bond is attached to the amino group of the capping aniline, and amino group involved in hydrogen bond formation is linked tot-butoxycarbonyl.

bioorganic chemistry; turn structure; intramolecular hydrogen bond; nuclear magnetic resonance spectroscopy; -Gly-L-Pro-Gly- segment; polypeptide

1008-1542(2016)05-0471-06

10.7535/hbkd.2016yx05007

2016-04-25；

2016-05-24；責任編輯：張士瑩

河北省引進留學人員資助項目(C2013003018)

張 勇(1972—)，男，河北滄州人，副教授，博士，主要從事藥物化學方面的研究。

E-mail:zhangyong@hebust.edu.cn

R979.9

A

張 勇，孫艷美，原現瑞，等.含有甘氨酸和L-脯氨酸多肽的轉角結構研究[J].河北科技大學學報,2016,37(5):471-476.

ZHANG Yong, SUN Yanmei, YUAN Xianrui, et al.Study on the turn structure of polypeptides containing glycine andL-proline[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2016,37(5):471-476.