用于農藥殘留現場快速檢測的微流控芯片研制

苑寶龍，王曉東，楊 平，范真真，黃昱俊，陳 炯，葉嘉明,3,*

（1.寧波大學海洋學院生物與海洋科學系，浙江 寧波 315211；2.浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006；3.國家食品安全風險評估中心應用技術合作中心，浙江 嘉興 314006）

用于農藥殘留現場快速檢測的微流控芯片研制

苑寶龍1,2，王曉東2，楊 平2，范真真2，黃昱俊2，陳 炯1,*，葉嘉明2,3,*

（1.寧波大學海洋學院生物與海洋科學系，浙江 寧波 315211；2.浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006；3.國家食品安全風險評估中心應用技術合作中心，浙江 嘉興 314006）

研制一種用于農藥殘留現場快速檢測的微流控芯片。設計制作的一次性高聚物微流控芯片集成進樣、酶抑制反 應、顯色反應及檢測單元，結合自制的手持式光度分析檢測裝置，可以實現對有機磷、氨基甲酸酯類農藥的現場、低成本、快速、準確的檢測。結果表明：通過在 芯片內部 固定存儲生化試劑，只需一次進樣，7 min內即可實現對克百威和樂果的快速檢測，最低檢出限分別為0.02、0.6 mg/L，對克百威加標回收率為95.0%～103.3%，制作的芯片在1 個月內的穩定性較好。使用微流控農藥殘留快速檢測芯片系統，有望實現全自動檢測流程，特別適合于基層非專業人員開展現場、快速、高通量的農藥殘留篩查。

微流控芯片；農藥殘留；快速檢測；低成本

農藥在農業生產中發揮著重要作用，它的使用可以有效保障或提高農作物的產量。當前我國的農藥生產量和使用量均排名世界前列，其中有機磷和氨基甲酸酯類農藥使用量占到了農藥總量的70%[1]，而且多使用于果蔬作物上。隨著農藥使用量的逐漸擴大及其降解處理的不完善，上述兩類農藥在蔬菜、水果等農產品中的殘留超標現象嚴重[2-4]。因此，為了確保廣大人民群眾的農產品食用安全，采取有效的檢測手段對農產品質量安全進行快速監測顯得尤為重要。

目前，用于農藥殘留的檢測方法主要包括兩大類：一類是以色譜-質譜聯用法[5-7]為代表的精密儀器分析方法；另一類是快速檢測方法，主要包括活體生物檢測法[8-10]、免疫法[11-13]、酶抑制法[14-16]、生物傳感器法[17-19]等。其中，精密儀器分析方法具有高靈敏度、高選擇性，可精確定量分析的優點，并可同時檢測多種農藥。但是該方法的儀器設備龐大，檢測成本高，耗時長，前處理繁瑣，需要專業人員操作，難以實現大批量樣品的現場快速篩查需求。快速檢測方法由于便攜、快速、簡單易用、低成本等顯著優點成為近年來研究的熱點。其中，酶抑制法基于比色法原理[20]，利用農藥靶標酶——乙酰膽堿酯酶（AChE）活性受抑制的程度，對有機磷和氨基甲酸酯類農藥進行半定量檢測，操作簡易，無需昂貴的儀器，尤其適用于保存時間相對較短的蔬菜、水果類鮮食農產品的農殘現場、快速檢測。因此該方法作為最常用的農殘速測手段被廣泛接受。現行的國家標準——蔬菜中有機磷與氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測[21]，主要包括農殘速測儀法和比色速測卡法，方法學上已能滿足大量農產品農殘初篩的需求，但是仍存在諸多不足之處，例如配件繁多，攜帶不便；操作繁瑣，過程冗長；準確率、靈敏度、重復性還有待提高；此外還需要專業人員操作。

微流控芯片又稱為芯片實驗室，是把生物、化學實驗室分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等操作單元微縮、集成到一張幾平方厘米的芯片上，通過對微通道網絡內流體的操縱和控制，自動完成分析過程。與傳統的分析方法比較，微流控芯片分析技術具有微型化、集成化、高通量、低成本的顯著優點，因此在食品安全快速檢測[22-24]、環境監測[25-27]、醫療診斷[28-30]等領域，具有重大的基礎研究和應用研究價值。

本實驗提出了一種用于農藥殘留現場快速檢測的微流控芯片，旨在使用一次性的高聚物芯片，配合自行研制的手持式檢測儀，基于酶抑制原理結合光度分析方法，實現對有機磷、氨基甲酸酯類農藥的現場、低成本、快速、準確的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小白菜 市購。

光學級聚甲基丙烯酸甲酯（p o l y m e t h y l methacrylate，PMMA）板材，0.3 mm、2.0 mm兩種厚度規格；光學級雙面膠，0.1 mm厚度；以上材料購自上海佰芯生物科技有限公司。

乙酰膽堿酯酶（EC 3.1.1.7，來自電鰻，217 U/mg）、碘化硫代乙酰膽堿、5,5-二硫二硝基苯甲酸 美國Sigma公司；克百威、樂果標準物 上海市農藥研究所；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和碳酸氫納均為分析純。

pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液：分別稱取11.9 g無水磷酸氫二鉀與3.2 g磷酸二氫鉀，去離子水定溶于1 000 mL容量瓶。顯色劑：分別稱取160.0 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氫納，用20 mL緩沖溶液溶解。底物：稱取25.0 mg硫代乙酰膽堿，加3.0 mL蒸餾水溶解。乙酰膽堿酯酶液：根據酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，DA0值應控制在0.3以上[21]；農藥標準液：準確稱量0.1 mg農藥標準品，加入10 mL丙酮（分析純，99.5%）溶解配制成質量濃度為10 mg/L的母液。使用時，根據需要用磷酸鹽緩沖溶液稀釋成不同質量濃度的標準液體。

1.2 儀器與設備

YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機（激光波長10.6 μm，連續激光輸出功率12 W，最細刻蝕寬度60 μm） 蘇州揚清芯片科技有限公司；DW系列超低溫保存箱（-86 ℃） 海爾生物醫療公司；Scientz-系列N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物技術股份有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；FA1604電子天平 上海精科實業有限公司；Milli-Q超純水系統（18 MΩ） 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 芯片的設計與制作

圖1 農殘檢測微流控芯片結構示意圖（A）和實物照片（B）Fig.1 Schematic presentation of the microfluidic chip for detection of pesticides (A) and photograph (B)

如圖1所示，本實驗所設計的微流控芯片由三層PMMA基片組成，頂層和底層為厚度0.3 mm的空白基片，中間層為厚度2 mm的通道層。其中2 個反應池的體積均為115 μL，流體通道橫截面為矩形，其寬度和深度分別為1 mm和0.5 mm，進樣通道和連接通道的長度和體積分別均為20 mm和10 μL。芯片的制作過程如下：首先，用Corel DRAW軟件設計芯片各層的結構圖案；其次，通過二氧化碳激光雕刻機直接在PMMA基材上雕刻反應池和微通道，同時切割獲得空白蓋板和底板；最后，用雙面膠將空白蓋板、刻有通道圖案的基片、空白底板逐層鍵合，制得一次性的農殘快速檢測芯片。

1.3.2 試劑的預存儲

芯片鍵合前，在圖1所示芯片的酶抑制反應池中加入5 μL酶溶液，在顯色反應與檢測池中依次加入5 μL顯色劑和5 μL底物溶液，超低溫冰箱-80 ℃預凍20 min后，置于真空冷凍干燥機內冷凍干燥。

1.3.3 流體的操控

為了精確進樣，需要制作了用于芯片內部微流體操控的微柱塞泵，其基本結構包括微型步進電機和與之匹配的微型氣缸。如圖2所示，使用時將氣缸導管與芯片的微泵接口連接，步進電機控制氣缸內活塞保證從芯片外部提取定量的待測液體至酶抑制反應池（步驟1）；并且，也能夠進一步精密操控液體轉移至顯色反應與檢測池（步驟2）。

圖2 進樣及液體在芯片內各反應池之間的轉移Fig.2 Solution aspiration and transportation in microchip

1.3.4 實驗室自制手持式檢測裝置

為配合集成生化反應的微流控芯片進行農藥殘留的現場快速檢測，本實驗搭建了一套手持式便攜檢測裝置（圖3），其基本組成包括光電檢測、流體控制、溫度控制和數據處理等模塊。

圖3 手持式便攜檢測裝置外觀（A）及模塊組成示意圖（B）Fig.3 Schematic illustration of portable detection device appearance (A) and composition diagram (B)

1.3.5 酶活性的檢測

參考Ellman等[31]的方法。吸取125 μL磷酸緩沖液至芯片酶抑制反應池，與預存儲酶混合溶解，37 ℃恒溫一段時間后進入顯色反應與檢測池進行顯色反應，記錄反應初始時與反應3 min時溶液在410 nm波長處吸光度的差值DA，作為酶活性。以最佳條件下的酶活力為100%，其余條件下同樣蛋白量的預存儲酶與最佳條件下的酶活力之比，記為相對酶活力。

1.3.6 農殘速測芯片的驗證

取農業生產中較常用到的有機磷類農藥樂果與氨基甲酸酯類農藥克百威，分別配制一系列質量濃度梯度標準液，吸取125 μL上述標準液加入芯片，在37 ℃恒溫條件下，農藥標準液在酶抑制反應池中與預存儲酶試劑發生酶抑制反應適當時間，反應液隨后進入顯色反應與檢測池進行顯色反應，記錄反應初始時與反應3 min時溶液在410 nm波長處吸光度的差值DA，按照酶抑制率公式計算各農藥標液的酶抑制率[21]。

2 結果與分析

2.1 芯片的結構設計及封裝

根據酶抑制率法快速檢測農殘的原理，在芯片上設計了2 級串聯反應池，其中酶抑制反應池底部固定酶，顯色反應與檢測池底部固定底物和顯色劑，反應池間用蛇形通道連接。檢測時待測液首先進入酶抑制反應池，在37 ℃恒溫條件下農藥組分與酶發生酶抑制反應，隨后混合液進入顯色反應與檢測池發生水解反應并顯色。檢測池的厚度，即光程對光學檢測結果的精度有較大的影響[32]，根據朗姆比爾定律，光程變長，靈敏度提高，檢出限變低，但同時會增加芯片的厚度導致物料成本上升。綜合考慮芯片物料成本、檢測試劑消耗量及檢測精度需求，本實驗選擇厚度為2 mm的PMMA板材制作微結構，2 個反應池的體積均為115 μL。

目前PMMA微流控芯片的封裝技術多采用熱壓鍵合法[33]，考慮到高溫條件下芯片內部固定化的酶試劑極易失活，本實驗采用雙面膠貼合法，在室溫條件下實現芯片的快速鍵合。

2.2 酶試劑存儲條件的確定

真空冷凍干燥目的是將生物材料制品凍干后保持其活性，適合長期保存，方便運輸，而且能快速復活利用[34]，該技術可以很好地滿足酶在芯片內部存儲的兩個條件：預存儲的酶在水溶液中能夠迅速溶解釋放，具有較高的反應活性；酶與芯片基材具有足夠的結合強度，以免芯片在使用過程中試劑脫落。在反應池加入5 μL酶液，-80 ℃預凍20 min后，在冷阱溫度-80 ℃、真空度3 Pa的條件下制備獲得固定于芯片的酶粉，著重考察冷凍干燥時間對酶活的影響。分別將預凍后的酶試劑真空冷凍干燥0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h，按照1.3.4節步驟測酶活性。如圖4所示，冷凍干燥2 h的相對酶活力最高，隨后酶活逐漸降低，其原因可能是隨著冷凍時間的延長，蛋白質分子表面的單層水分子被凍結，蛋白質表面的氫鍵以及極性基團暴露在周圍環境中導致蛋白質的變性失活[35]。因此本實驗選擇2 h作為最佳真空冷凍干燥時間，在此條件下酶試劑與芯片基材的結合強度完全能夠滿足實驗要求。

圖4 真空冷凍干燥時間對酶活性的影響Fig.4 Effect of vacuum freeze-drying time on enzymatic activity

2.3 微泵的穩定性測試

精確、穩定的流體控制是微流控分析重復性的前提保證。為了精確進樣，本實驗制作了基于步進電機耦合微型氣缸的微柱塞泵，進樣體積為0～200 μL，流速為0～20 μL/s。考慮到過快的液體流速會在反應腔室引入氣泡，實驗選取微泵的流速為10 μL/s，在該流速條件下往復抽取125 μL磷酸緩沖液，用天平稱量每次泵取液體的質量，重復6 次的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.9%，說明自制的微型計量泵能夠滿足微流控農殘檢測的要求。

2.4 光學檢測器的穩定性

配制0.04 g/L鉻酸鉀溶液，加入芯片檢測池后放入光學檢測裝置中[36]，每30 min測量波長410 nm處鉻酸鉀溶液吸光度，RSD（n=6）為0.8%，說明自制的光學檢測裝置能基本滿足實驗檢測的要求。

2.5 芯片中酶抑制反應時間的確定

常規條件下，酶抑制反應溶液需在37 ℃水浴鍋中恒溫反應10～15 min。針對本實驗芯片中的微反應體系，將質量濃度為0.1 mg/L的克百威標準液加入預恒溫37 ℃的芯片中，考察反應時間對農殘抑制率的影響。如圖5所示，當反應時間超過4 min后，農殘抑制率達到一穩定平臺。考慮到快速檢測需求，本實驗采用4 min作為芯片中酶抑制反應時間。

圖5 芯片中酶抑制反應時間對農殘抑制率的影響Fig.5 Effect of reaction time in the chip on inhibition of enzymatic activity

2.6 農藥標樣檢測及檢出限

分別配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5 mg/L的克百威農藥標準溶液，0.2、0.5、1、2、5、10、20 mg/L的樂果農藥標準溶液，按1.3.5節步驟進行檢測，結果如圖6所示。通過將抑制率與農藥質量濃度的標準曲線用Origin軟件擬合，可以計算出每種農藥抑制AChE活性50%所對應的質量濃度，即為本方法對該農藥的檢出限。對于克百威和樂果，國標速測儀方法檢出限為0.05 mg/L和3 mg/L[21]，本方法檢出限分別為0.02 mg/L和0.6 mg/L，因此本實驗所制備農藥殘留檢測芯片的檢出限優于現有國標速測儀檢出限標準，具有很強的實用價值。

圖6 克百威（A）和樂果（B）農藥標樣檢測結果Fig.6 Analytical results of carbofuran (A) and cygon (B)

2.7 回收率測定實驗結果

為考察方法的可靠性，進行了回收率實驗。以未噴灑農藥的小白菜為例，按國標法操作提取待測液，向提取液中加入定量的0.02 mg/L克百威農藥。回收率實驗測定了5 組樣品，每組測定6 次，測得農藥的回收率在95.0%～103.3%之間，結果見表1。

表1 加標檢測結果Table 1 Recoveries from spiked sample

2.8 芯片的穩定性實驗結果

將制備的農藥殘留檢測芯片分別在4 ℃和25 ℃密封存放，30 d后測得相對酶活力分別為95.4%、81.5%。由此可以看出，本實驗所制備的農殘檢測芯片比較穩定。

2.9 方法對比

為了驗證方法的可靠性，取同一噴灑農藥的小白菜樣品（樂果、克百威為例），按國標提取待測液后，選用某知名國產農殘速測儀與本實驗的微流控芯片快速檢測方法對比，二者綜合特性比較見表2、3。

表2 本實驗和農殘速測儀方法對比Table 2 Comparison of the developed method with rapid pesticideresidue analyzer

表3 本實驗和農殘速測儀檢測結果對比Table 3 Comparison of analytical results obtained for cabbage sampleusing the developed method and rapid pesticide residue analyzer

從表3可以看出，對比傳統的農殘速測方法，本實驗提出的微流控芯片直接將農藥殘留檢測試劑預存儲于芯片內部，無需現場配制溶液；檢測時間由20 min縮短為7 min；樣本及試劑消耗量降至常規檢測的1/20；操作簡便，檢測精度、重復性與準確性能夠滿足農藥殘留的現場快速檢測需求。

3 結 論

本實驗提出了一種用于農藥殘留現場快速檢測的微流控芯片制備方法。旨在使用一次性的高聚物芯片，配合自行研制的手持式檢測儀，基于酶抑制原理結合光度分析方法，實現對有機磷、氨基甲酸酯類農藥的現場、低成本、快速、準確的檢測。相對于現有的農殘速測儀和速測卡，本實驗研制的微流控芯片檢測方法優點包括：1）試劑、樣品消耗量小；2）試劑存儲于芯片中，降低人工配制及移取溶液試劑所帶來的誤差；3）可在芯片內部實現自動進樣、生化反應及檢測，最大程度地減少人工操作步驟；4）溶液反應體系封閉，進一步提高反應均一性和檢測準確度；5）使用高聚物為芯片基材，芯片成本低、易批量化生產，適合一次性農藥殘留檢測需求。此外，將本實驗研制的微流控芯片進一步結合手持式檢測儀，以及便攜式農殘快速提取儀，可實現全自動檢測流程，特別適合于基層非專業人員開展現場、快速、高通量的農藥殘留篩查。

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Fabrication and Analytical Application of Microfludic Chip for Rapid On-Site Detection of Pesticide Residues

YUAN Baolong1,2, WANG Xiaodong2, YANG Ping2, FANG Zhenzhen2, HUANG Yujun2, CHEN Jiong1,*, YE Jiaming2,3,*
(1. Department of Biology and Marine Science, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University, Jiaxing 314006, China; 3. China National Center for Food Safety Risk Assessment Cooperation Center for Application Technology, Jiaxing 314006, China)

A novel disposable microfludic chip was developed for rapid detection of pesticide residues in agricultural products, which integrated sampling, enzyme inhibition reaction, color development and detection chamber. By coupling with a laboratory-prepared colorimetric detection device, the chip could provide a simple, easy to use, low-cost and sensitive approach for rapid detection of organophosphate and carbamate pesticides on site. Due to pre-storage of biochemical reagents in the chip, the detection could be achiev ed within 7 min by just one injection. The limits of detection (LOD) of the method were 0.02 mg/L for carbofuran and 0.6 mg/L for dimethoate, the recoveries of carbofuran from spiked samples were in the range of 95.0% to 103.3%. Furthermore, this microfludic chip had a long storage life of up to 30 days. The microfluidic chip coupled with laboratory-prepared detection device is expected to achieve an automatic detection process, and is particularly suitable for on-site, rapid, and high-throughput screening of pesticide res idues by non-professionals.

microfludic chip; pesticide residues; rapid detection; low cost

10.7506/spkx1002-6630-201602035

TS207.3；S481.8

A

1002-6630（2016）02-0198-06

苑寶龍, 王曉東, 楊平, 等. 用于農藥殘留現場快速檢測的微流控芯片研制[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 198-203. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602035. http://www.spkx.net.cn

YUAN Baolong, WANG Xiaodong, YANG Ping, et al. Fabrication and analytical application of microfludic chip for rapid on-site detection of pesticide residues[J]. Food Science, 2016, 37(2): 198-203. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602035. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

嘉興市公益性應用技術研究計劃項目（2014AY21024）

苑寶龍（1976—），男，碩士，主要從事微流控芯片以及食品安全檢測研究。E-mail：yuanbaolong@hotmail.com

*通信作者：陳炯（1975—），男，研究員，博士，主要從事動物細胞因子及細胞免疫調控研究。E-mail：jchen1975@163.com

葉嘉明（1979—），男，高級工程師，博士，主要從事微流控分析芯片研發及其在生物醫學快速檢測研究。

E-mail：yejiaming723@126.com