茶葉中啶蟲脒殘留基體標準樣品的制備及測定

馬 維，劉樹興，陳 琦，吳雪原，葉誠誠

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.黃山出入境檢驗檢疫局，安徽 黃山 245000）

茶葉中啶蟲脒殘留基體標準樣品的制備及測定

馬 維1,2，劉樹興1,*，陳 琦2，吳雪原2，葉誠誠2

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.黃山出入境檢驗檢疫局，安徽 黃山 245000）

為了獲得含啶蟲脒殘留的茶葉基體標準物質用于分析化學實驗室質量體系控制，將啶蟲脒以0.05 mg/kg茶葉用量對有機成茶噴施啶蟲脒藥液，陰干后，磨粉，混勻獲得含啶蟲脒殘留的茶葉基體樣品。用隨機抽樣法對其進行均勻性檢驗，用直線模型法對其進行穩定性檢驗，并通過多個實驗室聯合對其定值。結果表明該樣品中啶蟲脒含量無顯著性差異，且在-10 ℃冷凍條件下儲存180 d內未觀察到明顯的降解趨勢。實驗室聯合測定，確定了該樣品中啶蟲脒的標準值為0.041 7 mg/kg，擴展不確定度（95%置信區間）為0.004 25 mg/kg。

茶葉；啶蟲脒殘留；基體標準樣品；制備；特性值

隨著人們對食品安全意識的不斷提高，以農藥殘留控制為核心的農產品衛生質量安全要求也越來越嚴格。控制農產品中農藥殘留量的關鍵環節之一是對農藥殘留量及時、準確的分析檢測[1]。在對農藥殘留檢測要求快速、靈敏的同時，檢測結果也應具有準確性、可靠性和可比性。在建立測量結果溯源性方面，基體標準物質具有重要作用。基體標準物質的使用是對分析系統從樣品到結果進行全面控制的有效方法[2]。越來越多的分析化學實驗室利用基體標準物質進行質量體系控制和能力驗證[3]。在我國，農藥基體標準物質還十分欠缺[4]。姜海燕等[5]對白菜汁中異丙甲草胺候選標準樣品的制備與定值進行了研究，余孔捷等[6-7]研制了茶葉中聯苯菊酯和毒死蜱殘留的自然基體標準樣品，Wong等[8]研制了含有機氯的草藥基體標準樣品，Adel等[9]對以魚油為天然基體材料的有機氯農藥進行了制備和認證。Saldanha等[10]對以胡蘿卜和土豆為基體材料的11 種在歐盟殘留限量水平的農藥均勻性和穩定性進行了評估。以上多位學者對農藥殘留基體標準物質制備技術的研究成果，促進了基體標準物質的發展。現有基體標準物質還包含無機物、營養素及產品品質特性基體標準物質等方面[11-18]，但未見加料法制備含啶蟲脒茶葉基體標準物質的報道。

啶蟲脒屬氯化煙堿類化合物，它作為一種廣譜殺蟲劑于1996年由日本曹達株式會社開發并廣泛使用，也成為我國茶葉生產推薦用藥。我國茶葉中啶蟲脒檢出率極高，茶葉中的農藥殘留會通過茶湯進入人體[19]，進而可能對人體健康產生不利影響。開展含啶蟲脒殘留的茶葉標準樣品的制備和定值的研究，對實驗室的能力驗證和監控、實驗室存在問題的識別和糾正、新方法有效性和可比性的確證及日常檢測工作的質量保證和質量控制具有重要意義。本實驗介紹了通過加料法快速制備歐盟最大殘留限量水平的啶蟲脒茶葉基體標準物質，并對樣品進行均勻性、穩定性檢驗及定值研究。經檢測，所制備的樣品均勻穩定，可以作為茶葉中啶蟲脒殘留分析用的基體標準物質使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：有機成茶，產自安徽。

啶蟲脒固體標準品（純度98.1%，實驗室A使用）德國Dr. Ehrenstorfer公司；標準品溶液：啶蟲脒標準溶液（100 μg/mL，介質乙醇） 農業部環境保護科研檢測所；水：GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》[20]規定的一級水；Cleanert TPT固相萃取柱（10 mL，2.0 g） 天津博納艾杰科技有限公司；微孔過濾膜（13 mm×0.22 μm） 島津技邇（上海）商貿有限公司；啶蟲脒固體標準品（純度99.0%，實驗室B使用） 國家農藥標樣分技術委員會。

1.2 儀器與設備

實驗室A：SFJ萬能粉碎機 上海申銀機械有限公司；B20-B多功能攪拌機 上海紅聯機械電器制造有限公司；SA320振蕩器 日本Yamato公司；N-1200B旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社；WAT200609固相萃取裝置 美國Waters公司；AL204-IC分析天平 美國Mettler公司；DPA-20勻漿機 美國Pro公司；EBA-21離心機 德國Hettich公司；1290-6410B高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Aglient公司；ULT1386-3-V超低溫冰箱美國Revoc公司。

實驗室B：AUW220D分析天平 日本島津公司；JJ-2B勻漿機 太原儀誠實驗設備有限公司；TG16WS高速離心機 上虞市博盛生物科技有限公司；R-210旋轉蒸發儀 瑞士Büchi公司；Quattro Premier高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品制備采用加料制備方式，在一間獨立的實驗室進行。取有機成茶3 kg，攤開面積4 m2，環境溫度25 ℃，相對濕度80%。將啶蟲脒固體標準品用乙腈溶解，配制成1 g/L的儲備液，使用時用900 mL丙酮-水（2∶1）稀釋成質量濃度為0.167 mg/mL的工作液，用手動噴霧器分3 輪，每輪300 mL，均勻噴施于茶葉上。噴灑時，控制噴霧器流量，使藥液以細小霧狀噴到攤開茶葉上，表面全部噴濕后，將茶葉聚攏，人工攪勻后再次攤開，反復多次。最后一次攪勻后，將茶葉攤開，分別于24 h和48 h后，進行第2輪、第3輪噴藥。噴藥完成后自然陰干（此實驗環境條件下約48 h）。將干茶葉用粉碎機粉碎，過200 目篩后，全部轉移到攪拌機內，以105 r/min轉速攪拌10 min，混勻。將混勻后的樣品分裝于采樣袋中，每袋100 g，密封冷凍保藏于-10 ℃冰箱中。

1.3.2 前處理方法

茶葉中啶蟲脒殘留的測定方法均參照GB/T 23205—2008《茶葉中448 種農藥及相關化學品殘留量的測定：液相色譜-串聯質譜法》[21]，準確稱取2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈溶液，在高速組織搗碎機上以15 000 r/min勻漿提取1 min，5 000 r/min離心5 min，上清液移入雞心瓶中，茶渣按上述方法重復提取2 次，合并3 次提取液于雞心瓶中，45 ℃水浴，旋轉濃縮至近干，加入5 mL乙腈溶解殘余物。在Cleanert TPT柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉，安裝在固相萃取裝置上并將柱子放入下接雞心瓶的固定架上。加樣前先用5 mL乙腈-甲苯（3∶l，V/V）預洗柱。當液面到達硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品提取液轉移至凈化柱上，并更換新雞心瓶接收。在Cleanert TPT柱上加上50 mL貯液器，用25 mL乙腈-甲苯（3∶l，V/V）溶液洗脫農藥，合并于雞心瓶中。并在45 ℃水浴中旋轉濃縮至干，1 mL乙腈溶解殘渣，經0.22 μm有機微孔濾膜過濾后，供高效液相色譜-串聯質譜測定。

1.3.3 高效液相色譜-串聯質譜測定條件

啶蟲脒測定儀器條件見表1。

表1 啶蟲脒高效液相色譜-串聯質譜測定條件Table 1 Conditions for detection of acetamiprid by HPLC-MS/MS

兩個實驗室啶蟲脒測定方法的回收率及精密度測定結果見表2。

表2 啶蟲脒的回收率及精密度測定結果Table 1 Conditions for detection of acetamiprid by HPLC-MS/MS

1.3.4 均勻性、穩定性檢驗及定值方法

根據GB/T 15000.3—2008《標準樣品工作導則：（3）標準樣品定值的一般原則和統計學原理》[22]的規定，對茶葉標準樣品特性值進行測定。

均勻性檢驗：從分裝前的樣品中隨機抽取7 個子樣，其中一個子樣為對比樣，將對比樣平行測定6 次，6 個子樣進行單次測定，將測定值按數理統計的原理，進行F檢驗和t檢驗，在95%的置信度下檢驗樣品的均勻性[23]。

穩定性檢驗：分別在第0、10、30、60、90、120、180天的時間點隨機取樣，平行測定2 份，根據測定結果進行-10 ℃冷凍條件下樣品的穩定性檢驗。

樣品定值：在茶葉通過了均勻性和穩定性檢驗后，將茶葉樣品分送多個實驗室，采用多實驗室聯合定值方法。選取水平相當的實驗室兩個，采用相同的測試方法，每個實驗室發樣2 份，在（至少）2 d或2 d以上進行6 次重復測量，所有的重復測量進行獨立校準，報告單次測量結果和估計值及不確定度。

2 結果與分析

2.1 均勻性檢驗

表3 均勻性檢驗測定值Table 3 The content of acetamiprid residues in homogeneity test

由表3可見，對兩組數據進行F檢驗，在顯著性水平α=0.05，自由度f1=5，f2=5時查F分布臨界值表，可知臨界值F0.05（5,5）=5.05，用統計軟件Excel計算數據的F值，計算結果F=0.977小于F臨界值，說明兩組數據方差齊。再進行方差齊性的t檢驗，在在顯著性水平α=0.05，自由度f=10時，查t分布臨界值表得t（0.05,10）=2.228，用Excel計算數據的t值計算，所得t=0.605小于t臨界值，說明兩組樣品啶蟲脒含量測定結果無顯著性差異，樣品是均勻的。

2.2 穩定性檢驗

各個時間點測得的農藥含量的平均值見表4。

表4 穩定性檢驗測定值Table 4 The content of acetamiprid residues in stability test

由于在此條件下，啶蟲脒降解沒有嚴格確認的動力學機理，故采用直線作為經驗模型，可表示為：

式中：β0、β1為回歸系數；ε為隨機誤差分量；X為時間；Y為茶葉樣品農藥質量濃度。

對于一個穩定的標準樣品，β1的期望值為0。即若該條件下茶葉中各農藥含量穩定，則該模型中的截距等于測定值，而斜率趨近于零。斜率的估計值按下式計算：

截距：

β1的標準偏差s：

式中：

若|β1|＜t（0.95,n-2）×s（β1），說明斜率不顯著。查表得，P=0.95，自由度n-2=5時，t-因子等于2.571，計算結果見表5。|β1|小于t（0.95,5）×s（β1），表明啶蟲脒在-10 ℃冷凍條件下存放180 d內無明顯的降解趨勢，未觀測到不穩定性。

表5 穩定性檢驗結果Table 5 Results of stability test

2.3 樣品定值

參與聯合定值的兩個實驗室的檢測結果見表6。

用格拉布斯法對兩個實驗室測得數據的有效性進行判斷，計算各組數據的Gi值：

式中：i為可疑值的排列序號；Xi為可疑值。

把計算值Gi與格拉布斯表給出的臨界值GP（n）比較，如果計算的Gi值大于表中的臨界值GP（n），則能判斷該測定數據是異常值，可以剔除。在P=0.95，n=6時，查格拉布斯表獲得臨界值：G0.95（6）=1.882。數據的Gi值見表7，各組數據的Gi值均小于臨界值，表明數據全部有效。

表6 實驗室聯合測定數據Table 6 The content of acetamiprid residues for joint certification inmultiple laboratories

表7 格拉布斯檢驗結果表Table 7 The results of grubbs test

定值結果由標準值和不確定度組成。忽略由樣品均勻性和穩定性引入的不確定度，僅考慮測定方法帶來的不確定度[24]。本實驗測定過程中的不確定度主要來源于4 個部分。校準過程引入的不確定度（Urel（c））包括有證標準品、標準儲備溶液和標準溶液稀釋產生的不確定度，其對應值為3.64%；體積引入的不確定度（Urel（V））主要包括定容、移液槍和溫度對體積產生的影響，對應值為0.982%；1290-6410B液相色譜串聯質譜儀穩定性引入的不確定度（Urel（LC-MS））為2.08%；測定過程隨機效應導致的不確定度為2.60%。

合成不確定度為：

擴展不確定度取包含因子k=2，包含概率為95%，則擴展不確定度為：

為了保證參加定值的實驗室測量數據的可靠性，對兩個實驗室進行比對[25]，計算兩個實驗室測量結果的比率值Eni：

式中：yi為第i個參加實驗室測量值；yR為實驗室測量參考值；N為參加實驗室數目；UL為參加實驗室報告的測量結果的擴展不確定度（包含概率95%）。

兩個實驗室工作的準確度水平大致相同，測量結果不確定度大致相同，因此測量結果的參考值采用兩個實驗室測量值的算數平均值，且U1U2=UL。測量結果和Eni值見表8。

表8 實驗室測量結果和Eni數Table 8 Results of two laboratories and Eni

兩個實驗室測量結果比率值|Eni|＜0.7，說明測量結果滿足判據要求，實驗室聯合定值結果見表9。實驗室聯合測定，確定了該樣品中啶蟲脒的標準值為0.041 7 mg/kg，擴展不確定度（95%置信區間）為0.004 25 mg/kg。

表9 茶葉標準樣品定值結果Table 9 Certified value of acetamiprid content in tea reference material

3 結 論

通過在有機成茶中噴灑一定量的啶蟲脒，陰干后，粉碎、混勻，得到含啶蟲脒殘留的茶葉基體材料，密封存儲于低溫環境下。通過均勻性、穩定性檢驗及實驗室聯合定值的結果表明：所制備的茶葉基體材料中啶蟲脒含量接近歐盟最大殘留限量水平（0.05 mg/kg），樣品均勻且性質穩定，可以作為茶葉中啶蟲脒殘留分析的基體標準物質使用。

[1] 王富華, 向甦州. 農藥殘留監測技術現狀分析[J]. 廣東農業科學, 2006(1): 78-80.

[2] JENKS P J, BOEKHOLT A H, MAASKANT J F, et al. Are certified reference materials a victim of quality systems? The need for working matrix-certified reference materials[J]. Fresenius’ Journal of Analytical Chemistry, 1998, 360(3/4): 366-369. DOI:10.1007/s002160050713.

[3] MCNAB W B. A general framework illustrating an approach to quantitative microbial food safety risk assessment[J]. Journal of Food Protection, 1998, 61(9): 1216-1228.

[4] 盧曉華, 紀潔. 我國食品分析用標準物質現狀分析[J]. 中國計量, 2007(4): 78-79.

[5] 姜海燕, 王建華, 郭翠. 白菜汁中異丙甲草胺候選標準樣品的制備與定值方法研究[J]. 農業災害研究, 2012, 2(4): 20-22.

[6] 余孔捷, 楊方, 黃杰, 等. 茶葉中聯苯菊酯殘留自然基體標準樣品的研制[J]. 食品科學, 2013, 34(8): 317-320. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201308068.

[7] 余孔捷, 黃杰, 王丹紅, 等. 含毒死蜱殘留茶葉自然基體標準樣品研制[J]. 分析試驗室, 2014, 33(11): 1342-1344.

[8] WONG Y C, WONG S K, KAM T T. Preparation of reference material for organochlorine pesticides in a herbal matrix[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 392(7/8): 1507-1513. DOI:10.1007/ s00216-008-2396-y.

[9] SHEHATA A B, TAHOUN I F. Preparation and certification of a fish oil natural matrix reference material for organochlorine pesticides[J]. Accreditation and Quality Assurance, 2010, 15(10): 563-568. DOI:10.1007/s00769-010-0678-5.

[10] SALDANHA H, OLSEN B S, ULBERTH F, et al. Feasibility study for producing a carrot/potato matrix reference material for 11 selected pesticides at EU MRL level: material processing, homogeneity and stability assessment[J]. Food Chemistry, 2012, 132(1): 567-573. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.10.071.

[11] 傅博強, 唐治玉, 王晶, 等. 腹瀉性貝類毒素基體標準物質的研制[J].計量學報, 2010, 31(增刊1): 166-169.

[12] CAROLI S, FORTE G, ALESSANDRELLI M, et al. A pilot study for the production of a certified reference material for trace elements in honey[J]. Microchemical Journal, 2000, 67(1/2/3): 227-233. DOI:10.1016/S0026-265X(00)00066-7.

[13] WELCH M J, COLBERT J C, GILL L M. The certification of SRM 1546-Meat Homogenate, a new reference material for nutrients in a high protein, high fat matrix[J]. Fresenius’ Journal of Analytical Chemistry, 2001, 370(1): 42-47. DOI:10.1007/s002160100705.

[14] KRSKA R, PETTERSSON H, JOSEPHS R D, et al. Zearalenone in maize: stability testing and matrix characterisation of a certified reference material[J]. Food Additives and Contaminants, 2003, 20(12): 1141-1152. DOI:10.1080/02652030310001615203.

[15] LI Han, GAO Yunhua, WU Di, et al. Study on matrix reference material of flavor nucleotides[J]. China Measurement and Test, 2014, 5: 75-78.

[16] 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院. GB/T 18795—2012 茶葉標準樣品的制備技術條件[S]. 北京: 中國標準出版社, 2013.

[17] 趙振東, 李冬梅, 畢良武, 等. 樟腦標準樣品的制備和定值研究[J]. 林產化學與工業, 2007, 27(3): 1-5. DOI:10.3321/ j.issn:0253-2417.2007.03.001.

[18] 余笑波, 葉子弘, 隋志偉, 等. 轉基因水稻克螟稻標準物質的初制備[J]. 計量學報, 2011, 32(6A): 101-105. DOI:10.3969/ j.issn.1000-1158.2011.z1.26.

[19] BAROOAH A K, BORTHAKUR M, KALITA J N, et al. Pesticide residues in tea and their intake assessment using brew facor[J]. 茶葉科學, 2011, 31(5): 419-426.

[20] 全國化學標準化技術委員會化學試劑分會. GB/T 6682—2008 分析實驗室用水規格和試驗方法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[21] 國家質量監督檢驗檢疫總局. GB/T 23205—2008 茶葉中448 種農藥及相關化學品殘留量的測定: 液相色譜-串聯質譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[22] 全國標準樣品技術委員會. GB/T 15000.3—2008 標準樣品工作導則: (3)標準樣品定值的一般原則和統計方法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[23] 唐丹舟, 宋金鳳, 張振祥, 等. 殘留分析用農藥標準品的制備[J]. 檢驗檢疫學, 2000, 10(3): 1-3; 33.

[24] 王建華, 李立, 郭翠. 白菜汁中3 種酰胺類除草劑候選標準樣品的制備與定值方法研究[J]. 化學分析計量, 2011, 2(4): 10-12. DOI:10.3969/j.issn.1008-6145.2011.04.003.

[25] 譚廣璐, 程傳玲, 王鵬. 多實驗室比對試驗結果分析[J]. 輕工科技, 2013(8): 128-129; 134.

Preparation and Characterization of Matrix Reference Material for the Determination of Acetamiprid Residues in Tea

MA Wei1,2, LIU Shuxing1,*, CHEN Qi2, WU Xueyuan2, YE Chengcheng2
(1. School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China; 2. Huangshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huangshan 245000, China)

This study aimed to obtain tea matrix reference material containing acetamiprid residues to be used for quality system control of analytical chemistry laboratory, Acetamiprid solutions were sprayed on organic tea at a dosage of 0.05 mg/kg. After being dried in the shade, milled and mixed, tea matrix sample containing acetamiprid residues was obtained. The homogeneity was tested by random sampling method and the stability was examined by linear model method. The certification was finally carried out by multiple laboratories. The results showed that the contents of acetamiprid were not significantly different in these samples and no significant degradation was observed within 180 days at -10 ℃. The certification results showed that the standard value of acetamiprid content of tea reference material was 0.0417 mg/kg and the expanded uncertainty (95% confidence interval) was 0.004 25 mg/kg.

tea; acetamiprid residues; matrix reference material; preparation; property value

10.7506/spkx1002-6630-201602032

TS207.7

A

1002-6630（2016）02-0182-05

馬維, 劉樹興, 陳琦, 等. 茶葉中啶蟲脒殘留基體標準樣品的制備及測定[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 182-186. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602032. http://www.spkx.net.cn

MA Wei, LIU Shuxing, CHEN Qi, et al. Preparation and characterization of matrix reference material for the determination of acetamiprid residues in tea[J]. Food Science, 2016, 37(2): 182-186. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602032. http://www.spkx.net.cn

2015-03-18

國家質檢總局科技計劃項目（2014IK138）

馬維（1991—），女，碩士研究生，主要從事食品加工與食品安全研究。E-mail：maweiwei71@live.com

*通信作者：劉樹興（1962—），男，教授，碩士，主要從事食品加工與食品添加劑應用研究。E-mail：liusx@sust.edu.cn