層層自組裝法制備百里香精油微膠囊條件優化

黃 晶，申莉莉，白友菊，馬治燦，陳加平，馮 武

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

層層自組裝法制備百里香精油微膠囊條件優化

黃 晶，申莉莉，白友菊，馬治燦，陳加平，馮 武*

（華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070）

采用層層自組裝的方法，以百里香精油乳化液納米微粒作為核心，利用殼聚糖和海藻酸鈉對百里香精油進行包埋；以司盤80和吐溫60復配乳化劑親水親油平衡（hydrophilic lipophilic balance，HLB）值、用量及油乳比例3 個因素進行實驗，確定乳化液最適制備條件；以壁材溶液質量濃度、組裝層數、每層組裝時間、攪拌速率、組裝溫度、壁材溶液pH值和固化劑用量進行單因素試驗，以主要因素設計正交試驗，確定最佳包埋條件。結果表明，乳化液制備條件為HLB值10、乳化劑用量6%、精油與乳化劑體積比1∶6，此條件下所制備的乳化微粒為模板，組裝層數4 層、攪拌速率1 040 r/min、每層組裝時間15 min、壁材溶液pH 5.0、組裝溫度30 ℃，此條件下包埋率最高為80.23%。

層層自組裝；微膠囊；百里香精油；正交試驗；包埋率

百里香精油具有強抗氧化性、抗菌效果好的特點，是高效的天然防腐劑、抗氧化劑及食品穩定劑[1]。然而，精油中的香氣成分容易揮發，與食品成分直接接觸會降低其作用，解決這一問題的措施之一就是微膠囊化技術。經過微膠囊化后，由于囊壁對囊芯的保護作用，使得囊芯呈現出特殊的穩定性，可以減少揮發，防止氧化，所以它可以貯存并在工業應用中保持較長的時間[2]。

殼聚糖（chitosan，CS）和海藻酸鈉（sodium alginate，ALG）是兩種具有生物活性、可生物降解、生物相容性好的材料，并且分別帶有聚陽離子和聚陰離子[3-4]。目前國內外關于精油微膠囊化的研究很多，其中應用層層自組裝法對精油進行包埋的研究比較少[5]。本研究采用乳化交聯技術，以乳化液微粒作為核心模板，并利用層層自組裝技術在其表面交替組裝CS/ALG[6-13]。層層自組裝技術相比于其他方法具有許多優點，其對成膜的基質無限制，能夠在納米尺度上對膠囊的大小、組成、結構、形態和囊壁厚度進行精確的控制，制備的微膠囊具備良好的機械和化學穩定性[14-15]。

利用高速攪拌技術、高壓均質技術及超聲分散技術制備的百里香精油乳化液納米微粒為核心，進行層層自組裝，獲得百里香精油微膠囊，通過將冷凍干燥的微膠囊粉末制備成粉包的形式與果蔬一起貯藏，實現精油緩慢釋放并對果蔬以熏蒸的形式加以保護。為百里香精油運用于果蔬防腐保鮮及貨架期的延長提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百里香精油 美國國際香精香料公司。

CS（脫乙酰度85%～95%）、ALG（500 cps）、95%乙醇、司盤80、吐溫80、司盤60、吐溫20、吐溫60（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV1700紫分光光度計 日本島津公司；PHS-25數顯pH計 上海理達儀器廠；KQ2200DE超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；ATS均質機 寧波新芝生物科技股份有限公司；WV GP470光學顯微鏡 上海徠卡顯微系統有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS粒徑儀英國馬爾文公司；Beta2-8LD冷凍干燥器 德國Christ公司；752型可見分光光度計 上海光博儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳化液制備

1.3.1.1 乳化劑相容性

[16]方法，將司盤與吐溫按質量比為5∶5混合后再與水混合，使混合表面活性劑體積分數為5%，40 ℃、1 560 r/min條件下將混合物攪拌乳化20 min，觀察司盤60與吐溫20、吐溫60、吐溫80 以及司盤80 與吐溫20、吐溫60、吐溫80 的相容性。

1.3.1.2 乳化劑親水親油平衡（hydrophilic lipophilic balance，HLB）值的確定

司盤80與吐溫60 復配成HLB值8、9、10、11、12、13、14，用量6%（體積分數，下同），精油與乳化劑體積比1∶6，攪拌（50 ℃、20 min、1 560 r/min），然后超聲（40 ℃、99 W、30 min），再高壓均質（20 ℃，1 000 bar，10 min）后測定Zeta電位。

1.3.1.3 精油與乳化劑體積比的確定

精油與乳化劑體積比為1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3，乳化劑用量6%、HLB值10條件下測定乳化液Zeta電位。

1.3.1.4 乳化劑用量的確定

在乳化劑用量為2%、4%、6%、8%、10%，精油與乳化劑體積比1∶6、HLB值10時，測定乳化液Zeta電位。

1.3.2 百里香精油微膠囊的制備

參考文獻[17]的方法稍作修改。向一定量乳化液中加入質量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g/100 mL CS溶液（氯化鈉0.5 mol/L，pH 4.5，溶于2%醋酸溶液），40 ℃、1 040 r/min速率攪拌組裝20 min后，在40 W、40 ℃條件下超聲分散10 min，得到乳液微粒表面組裝有一層CS的微球，測定電導率。

向組裝了一層的微球中分別加入質量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g/100 mL的ALG溶液（氯化鈉0.5 mol/L，pH 4.5），40 ℃、1 040 r/min速率攪拌20 min進行組裝，再在40 W、20 ℃超聲分散10 min，得到組裝了兩層的微球，測定電導率。

在組裝了兩層的微球中，分別加入20 mL質量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g/100 mL的CS（pH4.5，氯化鈉0.5 mol/L）溶液，40 ℃、1 040 r/min轉速攪拌20 min進行組裝，之后在40 W、40 ℃條件下超聲分散10 min，測定電導率。

重復2、3 層組裝的兩步，層層自組裝。待組裝到適宜層數后，用質量分數10% NaOH溶液調節pH 6.0，加入一定量固化劑氯化鈣，于4 ℃固化1 h，經冷凍干燥，得到固態微膠囊產品。

1.3.3 百里香精油標準曲線制作

移取10 μL百里香精油，用95%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻；再從這10 mL中分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL并用95%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻，在274 nm波長處測定其吸光度。以百里香精油體積為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4 Zeta電位的測定

取100 μL微膠囊懸浮液，用蒸餾水稀釋100 倍，對稀釋液進行Zeta電位測定。

1.3.5 百里香精油微膠囊制備單因素試驗

1.3.5.1 組裝層數的確定

微膠囊制備的攪拌速率1 040 r/min、每層組裝時間15 min、壁材溶液pH 4.5、固化劑（1.5%氯化鈣溶液）用量10%（體積分數，下同）、組裝溫度40 ℃時，分別制備層數分別為2、4、6、8層的微膠囊，測定其包埋率。

1.3.5.2 攪拌速率的確定

微膠囊制備的組裝層數4 層、每層組裝時間15 min、壁材溶液pH 4.5、固化劑用量10%、組裝溫度40 ℃時，分別在攪拌轉速為520、780、1 040、1 300、1 560 r/min的條件下制備微膠囊，測定其包埋率。

1.3.5.3 每層組裝時間的確定

微膠囊制備的組裝層數4 層、攪拌速率1 040 r/min、壁材溶液pH 4.5、固化劑用量10%、組裝溫度40 ℃時，分別在組裝時間15、20、25、30 min的條件下制備微膠囊，測定其包埋率。

1.3.5.4 壁材溶液pH值的確定

微膠囊制備的組裝層數4層、攪拌速率1 040 r/min、每層組裝時間15 min、固化劑用量10%、組裝溫度40 ℃時，分別在壁材溶液pH 3.5、4.0、4.5、5.0的條件下制備微膠囊，測定其包埋率。

1.3.5.5 固化劑用量的確定

微膠囊制備的組裝層數4層、攪拌速率1 040 r/min、每層組裝時間15 min、壁材溶液pH 4.5、組裝溫度40 ℃時，分別在固化劑用量2%、4%、6%、8%、10%的條件下制備微膠囊，測定其包埋率。

1.3.5.6 組裝溫度的確定

微膠囊制備的組裝層數4層、攪拌速率1 040 r/min、每層組裝時間15 min、壁材溶液pH 4.5、固化劑用量10%時，分別在組裝溫度20、30、40、50 ℃的條件下制備微膠囊，測定其包埋率。

1.3.6 百里香精油微膠囊制備正交試驗

表1 L9（34）正交試驗設計因素水平Table 1 Factors and their coded level used in L9(34) orthogonal array desiggnn

按照文獻[18]，進行正交試驗優化（表1）。根據單因素試驗方差分析結果確定每層組裝時間、壁材溶液pH值及組裝溫度3 個因素影響極顯著。對此3 個因素加上攪拌速率4 個單因素設計正交試驗，確定四因素三水平表，對結果進行極差分析。

1.3.7 微膠囊包埋率的測定

微膠囊表面油含量的測定：根據文獻[19-20]方法，稍作修改，精確稱取一定質量的百里香精油固態微膠囊，用5 mL 95%乙醇溶液迅速過濾，定容至10 mL，測定274 nm波長處紫外吸光度，根據標準曲線計算百里香精油表面油的含量。

微膠囊總油含量的測定：精確稱取0.01 g的百里香精油固態微膠囊，用5 mL 95%乙醇溶液室溫浸泡30 min，再在20 ℃、99 W進行超聲破碎15 min，再在室溫浸泡30 min，迅速過濾，將濾液定容至10 mL，測定274 nm波長處吸光度，根據標準曲線計算百里香精油表面油的含量。然后參見式（1）計算包埋率。

1.3.8 微膠囊產率的測定

參考文獻[21]的方法，得到冷凍干燥后的微膠囊粉末質量、制備微膠囊所用壁材的質量及所用百里香精油的質量、固化交聯所用固化劑的質量。產率公式見式（2）。

1.3.9 驗證實驗

由正交試驗結果分析得到微膠囊制備的最佳水平，利用該最佳水平的條件制備微膠囊，對其包埋率進行測定，以驗證該最優水平。

2 結果與分析

2.1 百里香精油標準曲線制作

由百里香精油對吸光度的標準曲線可得方程為y=8.00x-0.013 0，其相關性系數R2=0.999 1，表明百里香精油在0～0.1 μL內與吸光度線性相關性較高。標準曲線方程中，x為百里香精油含量/（μL/mL），y為274 nm波長處吸光度。

2.2 乳化液制備條件優化

2.2.1 乳化劑種類選擇

圖1 乳化劑復配穩定性Fig.1 Emulsifier stability

由圖1可知，不同乳化劑之間的相容性存在差異，其中司盤80和吐溫20、司盤80和吐溫60、司盤80與吐溫80復配可以得到穩定的乳化劑水溶液，這和乳化劑分子結構有關。司盤系列分子較小，而吐溫系列分子較大，當它們二者進行復配時，司盤插入吐溫間隙中。司盤80與吐溫80的兩者的相容性較好。而當司盤80與吐溫60復配時，兩者也具有良好的相容性。結合黏度分析，可知司盤80與吐溫60復配時所制得的乳化液黏度最大為26.4 mPa·s，而司盤80與吐溫80的黏度為20.1 mPa·s，而黏度越大，則乳化液越不容易沉降，故其穩定性是最好的，綜上分析，選擇司盤80與吐溫60進行復配。與吳成蘭[16]結果存在一定的差異，但最終結論最佳復配乳化劑組合為司盤80與吐溫60與他的結果一致。

2.2.2 乳化劑HLB值選擇

如圖2所示，HLB值為10時，Zeta電位絕對值最大，乳化顆粒之間分散性最大，所得乳化液最穩定。因為HLB值為10時最接近百里香精油乳化時的最適HLB值，而其他值則由于和10逐漸遠離而使得乳化效果變差。與已有研究[22]結論相符。

圖2 不同HLB值乳化劑制備乳化液Zetaa電位Fig.2 Zeta potential of emulsions with emulsifiers of different HLB values

圖3 不同精油與乳化劑體積比條件下乳化液Zetaa電位Fig.3 Zeta potential of emulsions with different ratios of oil to emulsifier

2.2.3 精油與乳化劑體積比選擇

如圖3所示，精油與乳化劑體積比為1∶6時，Zeta電位絕對值最大，乳化顆粒之間分散性最大，所得乳化液最穩定。因為精油與乳化劑比值較小時，乳化劑用量不能將精油進行充分的乳化，而當乳化劑用量過多時，乳化液含量過大，乳化微粒間分散性降低。

2.2.4 乳化劑用量選擇

圖4 不同乳化劑用量條件下乳化液Zetaa電位Fig.4 Zeta potential of emulsions with different concentrations of emulsifier

圖5 最佳乳化液光鏡圖（×40）Fig.5 Light micrograph of optimal emulsion (× 40)

如圖4所示，乳化劑用量為6%時，Zeta電位絕對值最大，乳化顆粒之間分散性最大，所得乳化液最穩定。因為精油與乳化劑比值較小時，乳化劑用量不能將精油進行充分的乳化，而當乳化劑用量過多時，乳化液質量濃度過大，乳化微粒間分散性降低。所得最佳乳化液見圖5。

2.3 百里香精油微膠囊制備工藝優化

2.3.1 壁材溶液質量濃度選擇

圖6 不同壁材溶液質量濃度條件下微球電導率變化Fig.6 Changes in conductivity of microspheres with different wall materials as a function of wall material concentration

如圖6所示，在進行微膠囊的第1層組裝時，隨著CS溶液質量濃度增加，電導率呈現先增加后減小的趨勢。由于隨著質量濃度的增加，CS分子組裝到微球表面量逐漸增加，使得微球導電性逐漸增加，而隨著CS質量濃度的繼續增加，分子間流動性變差，使得導電性又出現降低的趨勢。因此，選擇CS質量濃度為0.15 g/100 mL。在進行微膠囊的第2層組裝時，隨著ALG溶液質量濃度增加，電導率呈現先增加后減小的趨勢。由于隨著質量濃度的增加，ALG分子組裝到微球表面量逐漸增加，使得微球導電性逐漸增加，當ALG質量濃度繼續增加時導致分子間流動性變差，使得導電性又出現降低的趨勢。因此，選擇ALG質量濃度為0.20 g/100 mL。在進行微膠囊的第3層組裝時，隨著CS溶液質量濃度增加，電導率呈現先增加后減小的趨勢，在CS質量濃度為0.15 g/100 mL時電導率最大。因此，選擇CS質量濃度為0.15 g/100 mL來作為后面層層自組裝時的質量濃度。

圖7 不同組裝層數條件下微膠囊Zeta電位變化Fig.7 Changes in Zeta potential of microcapsules with different assembly layers

由圖7可知，隨著組裝層數的增加，微球表面Zeta電位出現正負交替變化，則說明，CS和ALG兩種壁材溶液在微球表面實現了有效的層層自組裝過程。符合研究表明的CS和ALG能夠成功進行層層自組裝的相關結論[23]。

2.3.2 組裝層數對包埋率的影響

表2 羅丹明B標記CS微球溶液吸光度Table 2 Absorbance values of rhodamine B labeled chitosanmicrosphere solutions

圖8 不同組裝層數條件下微膠囊包埋率Fig.8 Microencapsulation efficiencies with different assembled layers

由表2可知，采用羅丹明B標記的CS替代未標記的CS組裝到微球表面，隨著組裝層數的增加，在560 nm波長處可見光處吸光度增大，而當組裝到第3層之后，吸光度增加比較小，基本趨于穩定，則第4層之后CS組裝到微膠囊上的比較少，而且組裝過程中精油會損失，故組裝4 層最佳。并且結合包埋率測定結果（圖8）可知，在組裝層數為4 層時包埋率最大，由于在組裝層數太小時，精油裝載時間太短，還沒有充分地進入微球內部，而組裝層數過多時，精油出現了較大的損失。因此，選擇組裝層數為4層。

2.3.3 攪拌速率對微膠囊包埋率的影響

圖9 不同攪拌速率條件下微膠囊包埋率Fig.9 Microencapsulation efficiencies at different stirring speeds

由圖9可知，在攪拌速率為780 r/min時包埋率最大，由于在攪拌速率太小時，精油分子運動較緩慢，還沒有充分地進入微球內部就已揮發；而攪拌速率過快時，精油分子容易出現飛濺，產生較大的損失。因此，選擇攪拌速率為780 r/min。對此單因素進行方差分析得到其F值為2 352.63，而F0.05=5.96，F0.01=14.55，F＞F0.01，故該因素對包埋率影響極顯著。方差分析參考工具書[24]的方法進行計算與分析。

2.3.4 每層組裝時間對微膠囊包埋率的影響

圖10 不同每層組裝時間條件下微膠囊包埋率Fig.10 Microencapsulation efficiencies with different assembly times for each layer

由圖10可知，在每層組裝時間為20 min時包埋率最大，由于在組裝時間太短時，還沒有充分地進入微球內部就已揮發；而組裝時間過長時，精油分子容易揮發，產生較大的損失。因此，選擇組裝時間為20 min。對此單因素進行方差分析得到其F值為2.48，而F0.05=5.96，F0.01=14.55，F＜F0.05，故該因素對包埋率影響不顯著。

2.3.5 壁材溶液pH值對微膠囊包埋率的影響

圖11 不同壁材溶液pH值條件下微膠囊包埋率Fig.11 Microencapsulation efficiencies at different pH values of wall material solution

如圖11所示，對不同體系pH值形成的微膠囊的油脂包埋率進行測定，發現pH值為3.5～4.5時，包埋率逐漸增加，而當pH值由4.5增大到5.0，包埋率反而減少，這是由于此時CS和ALG產生的凝聚現象受到了抑制，形成的微膠囊較不穩定[25-26]。因此，選擇合適的pH值為4.5。對此單因素進行方差分析得到其F值為15.38，而F0.05=5.96，F0.01=14.55，F＞F0.01，故該因素對包埋率影響極顯著。

2.3.6 固化劑用量對微膠囊包埋率的影響

圖12 不同固化劑用量條件下微膠囊包埋率Fig.12 Microencapsulation efficiencies with different amounts of curing agent

由圖12可知，在固化劑用量為8%時包埋率最大，由于在固化劑用量太少時，形成的微膠囊結構不穩定；而固化劑用量過多時，形成的微膠囊結構致密，精油滲透進入微球內部的量減小或者在總油提取的過程中未能實現充分的提取。因此，選擇固化劑用量為8%。對此單因素進行方差分析得到其F值為4.34，而F0.05=5.96，F0.01=14.55，F＜F0.05，故該因素對包埋率影響不顯著。

2.3.7 組裝溫度對微膠囊包埋率的影響

圖13 不同組裝溫度條件下微膠囊包埋率Fig.13 Microencapsulation efficiencies at different assembly temperatures

由圖13可知，在組裝溫度為40℃時包埋率最大，由于在組裝溫度太低時，精油分子熱運動較弱，不能充分擴散進入微膠囊內部；而組裝溫度太高時，精油分子容易揮發，產生較大的損失。因此，選擇組裝溫度為40 ℃。對此單因素進行方差分析得到其F值為42.62，而F0.05=5.96，F0.01=14.55，F＞F0.01，故該因素對包埋率影響極顯著。

2.4 百里香精油微膠囊制備正交試驗

從單因素試驗結果可知，影響微膠囊油脂包埋率的各因素主要為壁材溶液pH值、組裝溫度、每層組裝時間和攪拌速率。由此4 個因素設計正交試驗，試驗設計及結果見表3。

(1)屬性anaType表示指代類型,即哪種要素的指代,或是事件的指代.若是對象要素的指代,屬性值為Object;若是時間要素的指代,屬性值為Time;若是環境要素的指代,屬性值為Location;若是事件的指代,屬性值為Event.

表3 百里香精油微膠囊正交試驗優化結果與分析Table 3 Orthogonal array design with analysis of experimental resultsfor thyme oil microcapsulation

從精油的利用率及來看，選擇包埋率最高的條件為最優制備條件，由表3可知，最佳組合為A3B1C3D1，即壁材溶液pH 5.0、組裝溫度30 ℃、每層組裝時間15 min、攪拌速率1 040 r/min。為了驗證試驗設計所得結果的可靠性，采用上述工藝進行百里香精油微膠囊的包埋實驗，得到包埋率為80.23%，與最優水平得到的結果相差很小，說明該最佳水平是可靠的。

3 結 論

通過正交試驗優化方法對百里香精油微膠囊包埋條件探索，結果表明最佳制備組合水平為A3B1C3D2，即攪拌速率1 040 r/min、每層組裝時間15 min、壁材溶液pH 5.0、組裝溫度30 ℃，此條件下包埋率為80.23%。

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Condition Optimization for Thyme Oil Microcapsules Prepared by Layer-by-Layer Self-Assembly Method

HUANG Jing, SHEN Lili, BAI Youju, MA Zhican, CHEN Jiaping, FENG Wu*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this work, using thyme oil emulsion nanoparticles as the core, chitosan (CS) and sodium alginate (ALG) were employed for embedding thyme essential oil by a layer-by-layer self-assembly method. Three emulsification conditions including HLB (hydrophilic lipophilic balance) value of 1:1 mixture of Span 80 and Tween 60, emulsifier concentration and ratio of oil to emulsifier were optimized to be 10, 6% and 1:6, respectively. The maximum microencapsulation efficiency of 80.23% was obtained when self-assembly of the emulsion particles in four layers by alternate use of CS and ALG was conducted for 15 min at 30 ℃ with stirring at a speed of 1 040 r/min, as determined by orthogonal array design.

self-assembly; microcapsule; thyme oil; orthogonal array design; embedding rate

10.7506/spkx1002-6630-201602009

TS202.3

A

1002-6630（2016）02-0051-07

黃晶, 申莉莉, 白友菊, 等. 層層自組裝法制備百里香精油微膠囊條件優化[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 51-57. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602009. http://www.spkx.net.cn

HUANG Jing, SHEN Lili, BAI Youju, et al. Condition optimization for thyme oil microcapsules prepared by layer-by-layer self-assembly method[J]. Food Science, 2016, 37(2): 51-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602009. http://www.spkx.net.cn

2015-05-25

華中農業大學預研項目（52209-814010）

黃晶（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：13163266519@163.com

*通信作者：馮武（1973—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：fengwuwen@163.com