TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖微球的制備及其在運載食品活性因子中的應用

陳鈺瑩，陳小冬，史夢璇，路美玲，趙陸海，李 媛

（北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029）

TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖微球的制備及其在運載食品活性因子中的應用

陳鈺瑩，陳小冬，史夢璇，路美玲，趙陸海，李 媛*

（北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029）

以2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2,2,6,6-tetramethyl-piperidine-1-oxyl，TEMPO）為催化劑，次氯酸鈉為氧化劑，對魔芋甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）進行氧化，制備出氧化度為80%的TEMPO氧化魔芋多糖（ TEMPO-oxidized konjac glucomannan，OKGM）。用OKGM為原料、Fe3+為交聯劑借助雙重乳液法制備微球。內油相中包覆β-胡蘿卜素，多糖水相吸附花色苷，實現親疏水活性因子的共裝載。紅外光譜顯示出KGM上羥基成功氧化為羧基；MTT法驗證了OKGM沒有細胞毒性；采用單因素試驗，確定制備微球的最佳工藝條件是OKGM質量分數10%、FeSO4·7H2O與OKGM質量比1∶5、交聯時間30 min、交聯溫度35 ℃；通過動態光散射法發現微球粒徑分布在20～40 μm之間，平均粒徑為26.8 μm；通過掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡觀察了微球的表面形貌；熒光共聚焦顯微鏡顯示微球中能夠同時分布著花色苷和β-胡蘿卜素。結果表明OKGM微球在多種活性因子的共裝載方面有良好的應用前景。

魔芋葡甘露聚糖；微球；活性因子；分散性；穩定性；腸靶向；緩釋；微膠囊化

食品天然產物活性因子往往具有增強機體免疫力、抗氧化和防止多種癌癥等重要生理功能，但因食品活性因子存在穩定性差的問題[1]，限制了其應用和人體營養吸收。而載體可以用來保護食品活性因子，維持其穩定性，并能提高其分散性，進而提高生物利用度[2]。天然高分子具有可再生、生物兼容性和降解性等優點，成為制備活性因子載體的最佳材料。目前運用于裝載活性因子的天然高分子有淀粉[3]、糊精類[4]、蛋白[5]、海藻酸鈉[6]等。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）主要成分為葡萄糖和甘露糖，二者通過β-1,4-或者β-1,3-糖苷鍵連接（圖1）[7]。KGM分子質量在500～2 000 kD之間，在水中的溶解度為1%左右，吸水膨脹后體積約為干狀態的80 倍。它具有良好的增稠性[8]、凝膠性、成膜性[9]和一些特殊的生理功能[10]，目前已被用于減肥、降脂[11]以及食品添加劑領域[12]。但由于KGM分子質量高，溶解度低，溶膠黏度大以及穩定性差，限制了KGM進一步的開發利用。KGM目前主要通過與其他生物大分子例如黃原膠復配的方式[13]或共價交聯的方法[14]作用于藥物緩釋領域。Suphat等[15]將經過高碘酸鈉氧化的魔芋多糖與殼聚糖通過靜電作用復配制膜，用來緩釋雙氯芬酸鈉；Huang Renliang等[16]通過自組裝將魔芋多糖與Fmoc-苯丙氨酸二肽形成水凝膠，并選用紫杉醇作為模型藥，通過控制魔芋多糖的添加量、分子質量、老化時間以及β-甘露聚糖酶用量來控制藥物釋放時間。但基于靜電復配作用形成的載體機械強度低，穩定性差；共價交聯所使用的交聯劑（主要是二異氰酸鹽、環氧化合物及醛類）存在細胞毒性，降低了載體的生物相容性和安全性[17]。因此需要開發一種穩定性強、安全性高的魔芋載體應用于裝載食品活性因子。

圖1 氧化魔芋的結構式Fig.1 TEMPO oxidation of konjac glucomannan

2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl，TEMPO）氧化法是近年來新起的一種具有高活性和高選擇性綠色環保氧化方法[18]。TEMPO是一種有機小分子催化劑。TEMPO氧化法反應條件溫和，催化劑用量少（0.1%），可通過固載化的方法避免殘留于原料中，并可循環使用。TEMPO氧化的優點是高選擇性和氧化度可控?？梢赃x擇性地氧化多糖的單糖單元（葡萄糖、甘露糖）上C-6位上的伯醇基團為羧基，且氧化度精確可控，最高可達90%。通過TEMPO氧化處理后的魔芋葡甘聚糖（oxidized konjac glucomannan，OKGM）溶解度提高、水溶膠黏度降低、穩定性增強，引入大量羧基作為功能基團能夠與Fe3+通過配位作用交聯[7]。利用乳液聚合法，通過Fe3+交聯OKGM可制成帶有可控負電荷的微球，該微球能夠吸附正電荷活性因子。進一步采用雙重乳液法可包埋脂溶性活性因子。

研究發現，相同濃度條件下多因子協同作用可產生遠大于單因子作用的抗氧化性[19]?；ㄉ兆鳛橐环N抗氧化劑，在水溶液中的穩定性極差，易受溶液pH值和溫度影響[20-21]。β-胡蘿卜素是VA前體，具有抗癌、預防心血管疾病的功效，但其難溶性和對光熱氧敏感的缺點也限制了其應用[22]。因此，若能有效提高花色苷和β-胡蘿卜素的穩定性并能使兩者協同作用，將為預防心血管、癌癥起到積極作用。鑒于此，本實驗嘗試用OKGM微球提高活性因子的穩定性和分散性，同時裝載多種活性因子，實現多種抗氧化劑協同作用，有效提高活性因子的生物利用率。

本研究首先對采用TEMPO氧化法制得OKGM上的羧基進行表征，然后摸索了利用通氧乳液聚合法制備的OKGM微球的最佳條件，包括油水比、鐵與羧基的質量比、反應時間、反應溫度。接著對所得到的OKGM微球的粒徑和表面形貌進行表征。最后對微球包埋活性因子的應用進行了初步探討，主要用該微球來吸附正電荷花色苷以及包埋β-胡蘿卜素，證實了氧化魔芋微球在共裝載多種活性因子方面具有廣闊的應用前景。并且，OKGM將成為一種新型活性因子微膠囊壁材，其pH值響應性使其具有腸靶向釋放的潛力。該研究對充分利用我國魔芋資源，提高敏感活性因子的分散性和穩定性，使其更有效地發揮營養健康功效具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KGM（純度98%） 湖北一致魔芋有限公司；β-甘露聚糖酶（比活力20 IU/mg） 諾維信公司； TEMPO、SUPE R-green Ⅰ、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-2,5-diphenytetrazoliumromide，MTT） 美國Sigma-Aldrich公司；紫薯花色苷 湖北紫鑫生物科技有限公司；β-胡蘿卜素（純度97%） 日本TCI公司；尼羅紅等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RCT磁力攪拌器 德國艾卡公司；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；SP2共聚焦激光掃描電鏡 德國萊卡公司；Nano-ZS激光粒度儀 英國馬爾文有限公司；UB100i光學顯微鏡 重慶澳浦光技術有限公司；Dimension FastScan原子力顯微鏡 美國維易科儀器公司；S-4700掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 OKGM的制備

稱取20 g KGM溶解到2 L沸水中。待KGM全部溶解后，向溶液中加入1 mg β-甘露聚糖酶，酶解溫度為50 ℃，酶解時間為10 min。將酶解后的KGM溶液移入水浴鍋，沸水浴10 min滅酶。用乙醇析出固體后進行真空冷凍干燥。

稱取8.2 g酶解后的KGM分散在200 mL水中，用磁力攪拌器攪拌并加入0.064 8 g TEMPO，用鹽酸調節溶液pH 10。向溶液中加入pH 10的次氯酸鈉溶液，氧化反應開始發生，當溶液pH值降低時，向溶液中逐滴加入 0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，使溶液pH值恒定為10。當氫氧化鈉溶液加入量為80 mL時，加入10 mL無水乙醇終止反應。1 h后用濃鹽酸調節溶液pH 3，再調節pH值為7并保持該pH值1 h后停止攪拌。緩慢加入300 mL無水乙醇，過濾析出白色沉淀，用乙醇洗滌3 次，丙酮洗滌3 次。將沉淀出來的固體溶于50 mL水中，真空冷凍干燥后得到OKGM。

1.3.2 OKGM結構紅外光譜表征

稱取2 mg KGM和OKGM制成KBr壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1的范圍內進行紅外吸收掃描。

1.3.3 OKGM細胞毒性實驗

取人體肝癌細胞株HepG2和人體子宮頸癌細胞株Hela分別接種于96 孔板，每孔接種5 000 個細胞，置于37 ℃細胞培養箱培養，在培養基中加入OKGM，OKGM質量濃度在0.01～1 mg/mL之間。培養24 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h，每孔加入150 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），用酶標儀測定每孔在490 nm波長的吸光度，計算細胞存活率。

1.3.4 OKGM微球的制備

單乳液法：稱取一定量的OKGM溶解于水中，用0.1mol/L的鹽酸調節溶液pH 3。稱取一定質量的FeSO4·7H2O溶解于500 μL pH 3的OKGM溶液中制成水相，另稱取0.75 g司盤80溶解在20 g的液體石蠟中制成油相。將水相加入油相中，用磁力攪拌器攪拌形成W/O乳液。雙重乳液法：在上述水相中加入溶有脂溶性活性因子（例如β-胡蘿卜素）的玉米油（內油相），形成O/W乳液，再以此為水相加入到液體石蠟中，最終形成O/W/O的復乳。向上述兩種乳液中通入空氣，可以分別制得不含內油相和含有內油相的氧化魔芋微球。

微球用正己烷和甲醇分別洗滌3 次，離心分離，真空干燥。采用單因素試驗的方法，依次考察OKGM質量分數（4 %、6.7 %、10 %）、FeSO4·7H2O與OKGM質量比（0.45∶5、1∶5、1.95∶5）、交聯溫度（15、35、55 ℃）和交聯時間（30、40、60 min）對微球制備的影響，以選取最佳的條件，優化制備微球的工藝。

1.3.5 微球尺寸測量及形貌觀察

在最佳的制備條件下制備微球，并對微球的尺寸和形貌進行測量和觀察。

用馬爾文激光粒度儀測定微球的粒度分布情況。對微球表面進行噴金處理后，用掃描電子顯微鏡掃描（測試的加速電壓為15 kV），觀察微球大小和形貌。取微球溶解于pH 3鹽酸溶液中，用滴管吸取少量含有微球的溶液滴于云母片上，在空氣中自然風干后放于載物臺上，采用原子力顯微鏡輕敲模式觀察微球形貌。

1.3.6 單乳液法制備的微球吸附花青素

稱取一定量的微球溶解在pH 3的鹽酸溶液中，加入花色苷，用磁力攪拌器攪拌1.5 h，用pH 3的鹽酸溶液洗滌，離心，移去未被吸附的花色苷。利用花色苷自發熒光的特性，在共聚焦激光掃描電鏡下（激發波長為488 nm，發射波長為505 nm），觀測花色苷的吸附情況。

1.3.7 雙重乳液法制備的微球吸附β-胡蘿卜素和花色苷

稱取一定量的OKGM溶于500 μL pH 3的鹽酸溶液中，用磁力攪拌器攪拌溶解后，加入15 mg吐溫20制成水相。另稱取β-胡蘿卜素溶解在玉米油中制成油相，將水相加入油相中，制成初乳。向初乳中加入FeSO4·7H2O，用磁力攪拌器攪拌均勻。稱取0.5 g司盤80加入到50 mL液體石蠟中，制成外油相。將初乳緩慢滴加到外油相中，連續攪拌，制成雙重乳液。向乳液中通入空氣，并不斷攪拌。含有β-胡蘿卜素的微球用正己烷和甲醇分別洗滌3 次，離心分離，真空干燥。稱取一定量的微球溶解在pH 3的鹽酸溶液中，加入花色苷，用磁力攪拌器攪拌一段時間后，用pH 3的鹽酸溶液洗滌，離心，移去未被吸附的花色苷。

為了觀測利用雙重乳液法制備的微球共裝載親疏水物質的可行性，本實驗用尼羅紅代表疏水性活性分子，SUPER-greenⅠ代表親水性活性因子。將尼羅紅溶到內油相中，之后加入正電荷染料SUPER-greenⅠ通過靜電作用結合到含有多糖的水相中。洗去未被吸附的染料之后，用共聚焦激光掃描電鏡觀察雙染色的微球。尼羅紅激發和發射波長分別為561 nm和636 nm。SUPER-greenⅠ的激發和發射波長分別是488 nm和520 nm。利用兩種染料在不同波段發射而顯示出不同顏色，可以同時觀察到水溶性和油溶性分子在微球中的分布。

2 結果與分析

2.1 OKGM的制備及體外毒性分析

圖2 氧化魔芋的紅外表征Fig.2 FT-IR spectra of TEMPO-oxidized konjac glucomannan

如圖2所示，1 600～1 650 cm-1是多糖羧基的特征峰位置，KGM經過氧化后，1 620 cm-1附近的羧基吸收峰顯著增強，說明經過TEMPO氧化后，KGM上羥基成功氧化為羧基。且由之前的研究可知，羧基量和氧化度呈正比，氧化度精確可控[23]。

圖3 OKGM體外毒性實驗Fig.3 In vitro cytotoxicity of DO80% OKGM polymers

由于細胞吞噬微米級魔芋微球的能力有限，因此本實驗首先驗證了TEMPO氧化KGM的細胞毒性。通過利用MTT法，將OKGM和細胞共孵育24 h，細胞毒性結果如圖3所示，當OKGM質量濃度從0.01 mg/mL增加到1 mg/mL時，發現人體肝癌細胞HepG2的細胞存活率在90%以上，人體子宮頸癌細胞Hela的細胞存活率在80%以上，由此可見OKGM的細胞毒性可以忽略。若需要驗證鐵交聯后的OKGM微球毒性，可通過急性毒性實驗來進一步證明。

2.2 微球制備工藝的優化

OKGM質量分數、交聯度、交聯溫度和時間都是影響微球制備的關鍵因素。將不同條件下制得的微球在顯微鏡下觀察，探討通過O/W/O復乳法制備含有內油相的氧化魔芋微球的最優條件。由圖4A可以看出，當OKGM質量分數為4%時，顯然OKGM質量分數過低造成微球結構脆弱，發生破裂。而6.7%的質量分數仍然無法制備出結構堅固的微球。當質量分數為10%時，微球穩固存在，且內油相均勻分布于微球中，形成的微球形狀規則。因此初步確定10%為制備微球的最佳質量分數。氧化魔芋微球的交聯原理是OKGM上的羧基和三價鐵離子發生了配位反應。利用空氣中的氧氣能使預交聯劑Fe2+氧化為交聯劑Fe3+，Fe3+將OKGM交聯使其在水相中固化，最終制得氧化魔芋微球。因此鐵離子質量分數直接決定了微球的交聯度。由圖4B可以看出，當FeSO4·7H2O與OKGM質量比為0.45∶5時，交聯度過低，不能很好地形成微球。當質量比為1.95∶5時，形成的微球發生團聚，這是由于過量的Fe2+中和了羧基的負電荷，減弱了微球之間的排斥力，引起團聚。質量比1∶5時，形成的微球形狀規則，分散性較好。所以1∶5確定為最佳的交聯比例。溫度可以影響Fe2+氧化為Fe3+的化學反應動力學，也因此影響到微球形成的動力學。如圖5C所示，當溫度為15 ℃時，微球呈透明狀，說明交聯度較弱。當反應溫度為55 ℃時，反應過快，引起微球團聚。當溫度為35 ℃時，微球交聯密度提高且分散性較好。從圖4D可以看出，當交聯時間為30 min時，OKGM微球形成，且形狀規則，分散性好。當交聯時間超過30 min時，微球開始團聚，且隨著反應時間的延長，團聚現象加重。因此選擇30 min作為最適合的反應時間。

圖4 各因素對微球制備的影響Fig.4 Effects of polysaccharide concentration (A), cross-linker concentration (B), temperature (C) and reaction time (D) on (O/W) OKGM microsphere formation by the double emulsion method

綜上所述，形成微球的最佳條件是：OKGM質量分數10%、預交聯劑FeSO4·7H2O與OKGM質量比1∶5、交聯時間30 min、交聯溫度35 ℃。

2.3 微球尺寸測量及形貌觀察

圖5 微球的粒徑分布Fig.5 Size distribution of microspheres

如圖5所示，微球粒徑主要集中在20～40 μm之間，平均粒徑為26.8 μm。

圖6 掃描電鏡下微球的形態Fig.6 Morphology of mirospheres under SEM

如圖6所示，微球呈光滑球形，大小在幾微米到幾十微米之間，和圖5 的粒徑分布結果相符。

圖7 原子力顯微鏡下微球的形態Fig.7 Morphology of microspheres under AFM

原子力顯微鏡可以進一步觀察到納米尺度的微球表面細微結構，圖7B顯示的是微球表面褶皺，褶皺的平均厚度約3 nm，這可能是由多糖和鐵在微球表面的交聯反應不均一造成的。

2.4 單乳液法制備的微球吸附花色苷

圖8 熒光分光光度計下微球吸附花色苷圖Fig.8 CLSM images of anthocyanin s encapsulated in OKGM micr ospheres

采用W/O單乳液法可制備不含內油相的氧化魔芋微球。負電荷氧化微球可用來吸附正電荷的活性因子?；ㄉ找蛟趐H 3的條件下帶正電荷，能夠通過靜電作用吸附于OKGM微球中。花色苷也是一種天然熒光劑，可以被488 nm波長的光激發發射產生熒光。共聚焦激光掃描顯微鏡可以聚焦到樣品中心的微米級薄厚，因此利用此手段，能夠觀察到花色苷在微球中心薄層中的分布。如圖8所示，花色苷均勻地分散在微球內部，這表明OKGM微球能夠成功吸附花色苷。前期研究表明TEMPO氧化淀粉水凝膠同樣可以吸附花色苷，并且吸附受鹽質量濃度以及溶液的pH值影響[24]。該結果表明OKGM可以成功地吸附正電荷的活性小分子。

2.5 雙重乳液法制備的微球共裝載親疏水性小分子

圖9 熒光分光光度計下微球 同時吸附脂溶性、水溶性藥物圖Fig.9 CLSM images of co-delivery of hydrophobic and hydrophilic drugs in OKGM microspheres

如果利用O/W/O雙重乳液法，可制備出含有內油相的OKGM微球，在內油相中溶有疏水性活性因子，例如β-胡蘿卜素，可解決難溶性活性因子的水溶性和穩定性問題。如果再通過靜電吸附作用吸附正電荷親水小分子，可使OKGM微球同時遞送疏水和親水性活性分子，協同發揮作用，抗氧化能力更強。為了驗證該想法的可行性，用熒光染料尼羅紅和SUPER-greenⅠ分別代表疏水性和親水性小分子，兩者激發后可以在不同波段發射出不同顏色的熒光，這樣便可借助熒光分光光度計觀察和區分兩者在微球中的分布。如圖9所示，紅色的內油相和綠色的水相表明微球可以成功地包埋和吸附疏水性和親水性分子。實驗表明該微球可以同時吸附β-胡蘿卜素和花色苷。由于三價鐵在酸性條件下穩定而在堿性條件下易和水反應生成鐵的氧化物。因此OKGM微球在胃酸條件下穩定，在腸中性環境下破裂釋放出被包埋物質，因此，pH值相應的OKGM微球也具有腸靶向釋放營養物質的功能[25]。

3 結 論

以TEMPO氧化得到的OKGM為原料，鐵離子為交聯劑，通過物理交聯的方式制得了氧化魔芋微球。通過雙重乳液交聯法制得含有內油相的氧化魔芋微球，可實現親疏水活性因子的共裝載。采用單因素試驗，確定制備微球的最佳工藝條件是OKGM質量分數10%、FeSO4·7H2O與OKGM質量比1∶5、交聯時間30 min、交聯溫度35 ℃。

本研究提供了一種以氧化KGM為新材料制備微球實現活性因子穩態化的新策略，該微球可提高難溶性和敏感活性因子的分散性和穩定性，并同時裝載多種活性因子，在食品工業中具有較好的應用前景。

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Preparation and Application of TEMPO-Oxidized Konjac Glucomannan Micropsheres in Delivery of Food Bioactives

CHEN Yuying, CHEN Xiaodong, SHI Mengxuan, LU Meiling, ZHAO Luhai, LI Yuan*
(College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China)

2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy (TEMPO) was applied to catalyze the oxidation of konjac glucomannan (KGM), which was selectively oxidized by sodium hypochloryte to 80% degree of oxidization (DO) yielding TEMPO-oxidized konjac glucomannan (OKGM). A microsphere delivery system that allowed the co-delivery of hydrophobic and hydrophilic ingredients was prepared by cross-linking the carboxyl groups of TEMPO-OKGM polymers with ferric ions through double emulsion cross-linking reaction which enabled the dissolution of β-carotene in the inner oil phase and the absorption of anthocyanins to the polymer phase. Fourier transform infrared spectroscopic (FT-IR) results proved the oxidation of the hydroxyl groups into carboxyl groups. The cell viability experiment showed that the OKGM polymer had negligible cytotoxicity. The optimum conditions for OKGM microspheres preparation were as follows: OKGM concentration, 10%; mass ratio of cross-linker FeSO47H2O to polymer, 1:5; cross-linking time, 30 minutes; and reaction temperature, 35 ℃. The size distribution of OKGM microspheres measured by dynamic light scattering was 20 to 40 μm, and the av erage diameter was 26.8 μm. The surface morphology of microspheres was observed by scanning electron microscopy and atomic force microscopy. By confocal laser scanning microscopy, the distribution of hydrophobic and hydrophilic ingredients was observed simultaneously. OKGM microspheres showed a great potential for delivering multiple nutrients.

konjac glucomannan; microspheres; bioactive ingredients; dispersibility; stability; intestine-specific; controlled release; microencapsulation

10.7506/spkx1002-6630-201602001

TS201.2

A

1002-6630（2016）02-0001-06

陳鈺瑩, 陳小冬, 史夢璇, 等. TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖微球的制備及其在運載食品活性因子中的應用[J]. 食品科學, 2016, 37(2): 1-6. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602001. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yuying, CHEN Xiaodong, SHI Mengxuan, et al. Preparation and application of TEMPO-oxidized konjac glucomannan micropsheres in delivery of food bioactives[J]. Food Science, 2016, 37(2): 1-6. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602001. http://www.spkx.net.cn

2015-05-18

國家自然科學基金青年科學基金項目（31471577）；國家自然科學基金面上項目（31201334）

陳鈺瑩（1990—），女，碩士，研究方向為食品生物大分子載體、食品膠體科學。E-mail：chenyuxiaoying@163.com *通信作者：李媛（1982—），女，副教授，博士，研究方向為活性因子穩態化、食品生物大分子載體、食品膠體科學。E-mail：liyuan@mail.buct.edu.cn