NF-BP65和BCL-2蛋白在涎腺腺樣囊性癌中的表達與其預后關系的研究

陳昌暉，肖維華

陳昌暉，肖維華

目的探討NF-BP65與BCL-2蛋白在涎腺腺樣囊性癌中的表達意義及與預后的關系。方法采用免疫組化SP法檢測30例涎腺腺樣囊性癌組織中NF-BP65與BCL-2蛋白表達水平，以多形性腺瘤、癌旁正常涎腺組織作為對照。結果涎腺腺樣囊性癌、多形性腺瘤和正常涎腺組織中NF-BP65表達的陽性率分別為83.3%、33.3%和10.0%，BCL-2表達的陽性率分別為63.3%、26.7%和10.0%，兩者表達在腫瘤組與對照組中差異均有統計學意義（均＜0.05）；NF-BP65與BCL-2表達呈正相關關系（=0.712，＜0.05）；NF-BP65、BCL-2表達對腺樣囊性癌患者的5年生存率均無明顯影響。結論NF-BP65和BCL-2在涎腺腺樣囊性癌中均有較高水平表達，在與多形性腺瘤比較中亦有一定鑒別診斷價值，兩者表達與腺樣囊性癌5年生存率無關。

腺樣囊性癌；NF-BP65；BCL-2；免疫組化

涎腺腺樣囊性癌（ACC）是一種較常見的涎腺惡性腫瘤，侵襲性強，早期即侵犯神經，易轉移和復發。NF-BP65是最先在成熟的B細胞中被發現的一種核轉錄蛋白［1-2］。BCL-2是迄今研究的最深入和廣泛的凋亡調控基因蛋白之一［3］。鑒于此，本研究采用免疫組化SP法檢測NF-BP65和BCL-2在ACC、多形性腺瘤（PA）及正常涎腺組織（NSGT）的表達水平，以分析NF-BP65和BCL-2在ACC中的表達情況及意義，同時探討兩者的相關性、可能的機制及對預后的影響。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2006年1月至

2009年12月南昌大學第二附屬醫院口腔頜面外科收治的涎腺ACC手術患者30例，以切除的ACC組織為實驗組。同時收集PA組織30例為腫瘤對照組，NSGT組織30例為正常對照組。實驗組男11例，女28例；年齡14～85歲；發生于腮腺有7例，頜下腺5例，腭部9例，上頜竇4例，舌4例，鼻腔1例；ACC直徑＜1cm者15例，＞3cm者6例，介于兩者間9例。隨訪時間以術后第2天開始計算，對患者5年生存情況進行隨訪，截止日期2014年12月31日。30例ACC除一例失訪外，其余29例患者生存時間范圍為8～96個月。所有患者術前未進行放化療治療。所有標本經病理檢查確診后經10%甲醛固定，常規石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑小鼠抗人NF-BP65單克隆抗體試劑盒和小鼠抗人BCL-2單克隆抗體試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色（EliVisionTM plus二步法）標本制成4 m石蠟切片，經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化和PBS（pH=7.4）沖洗后，切片放入高壓鍋中進行高溫抗原修復，冷卻后用PBS液沖洗，室溫下孵育10 min，加1滴一抗，置于4℃冰箱內過夜。第2天PBS沖洗結束后，加1滴聚合物增強劑，室溫孵育20min。加1滴酶標抗兔聚合物，室溫孵育30 min。重復PBS沖洗步驟一次，加1滴新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間。水洗、蘇木素復染、0.1%HCL分化和PBS返藍。切片經酒精脫水干燥、二甲苯透明和樹膠封片，最后在顯微鏡下觀察組織。

1.3 免疫組化陽性判斷標準NFBP65以胞漿或胞核出現棕黃色顆粒為陽性；BCL-2以胞漿或胞膜出現棕黃色顆粒為陽性。以陽性細胞所占比率＜10%判定為陰性（-），10%～25%為弱陽性（+），26%～50%為中陽性（2+），＞51%為強陽性（3+）。弱陽性、中陽性及強陽性均記為陽性。

1.4 統計方法采用SPSS 16.0統計軟件包進行統計學分析，計數資料以率表示，采用檢驗；NF-BP65與BCL-2表達相關性分析采用相關分析；對ACC預后的影響采用單因素生存分析及檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT的陽性表達率差異有統計學意義（=27.07，＜0.05）；AAC與PA的陽性表達率差異有統計學意義（＜0.05）；AAC與NSGT的陽性表達率差異有統計學意義（＜0.05）；PA與NSGT的陽性表達率差異無統計學意義（=0.06）。見表1、圖1～2。

2.2 BCL-2在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達BCL-2在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達陽性率差異有統計學意義（=12.51，＜0.05）；AAC與PA表達陽性率差異有統計學意義（＜0.05）；；AAC與NSGT表達陽性率差異有統計學意義（＜0.05）；PA與NSGT表達陽性率差異無統計學意義（=0.28）。見表2、圖3～4。

2.3 NF-BP65與BCL-2表達在涎腺ACC中的相關性分析30例涎腺ACC中NF-BP65陽性表達病例中有19例BCL-2蛋白表達陽性；Pearson相關分析顯示，NF-BP65與BCL-2表達呈正相關關系（=0.71，＜0.05）。見表3。

2.4 隨訪資料統計實驗組ACC病例除一例失訪外，均進行定期隨訪，隨訪率為93.5%（29/30），5年累積生存率62.07%（18/29），術后無瘤生存率37.93%（11/29），帶瘤生存率13.79%（4/29），復發生存比10.34%（2/29），轉移生存比3.45%（1/29）。死亡11例，5年累積病死率為37.93%，中途失訪病例不計入預后因素統計范圍。

2.5 單因素生存分析

2.5.1 NF-BP65表達與涎腺ACC預后的關系對2例隨訪病例進行Kaplan-Meier生存分析，結果顯示：隨訪期內NF-BP65表達陰性患者平均生存期為（67.0±7.6）個月，中位生存期為（59.0±7.5）個月；95%分別為（52.0～82.0）和（44.3～73.70）個月。NF-BP65表達陽性患者平均生存期為（50.3±5.0）個月，中位生存期為（56.0±7.5）個月；95%分別為（40.5～60.2）和（41.3～70.7）個月。單純NF-BP65表達陽性與陰性5年生存率差異無統計學意義（=0.45）。見圖5。

2.5.2 BCL-2表達與涎腺ACC預后的關系BCL-2表達陰性患者平均生存期為（63.4±6.7）個月，中位生存期為（64.0±7.1）個月；95%分別為（50.2～76.6）和（50.0～77.9）個月。BCL-2表達陽性患者平均生存期為（46.9±5.6）個月，中位生存期為（56.0±11.6）個月；95%分別為（35.9～58.0）和（33.2～78.7）個月。單純BCL-2表達陽性與陰性5年生存率差異無統計學意義（=0.09）。見圖6。

3 討論

NF-BP65是一種功能復雜的核轉錄因子，參與基因轉錄的起始調節，與多種趨化、生長和黏附相關的因子有關。同時NF-BP65還參與機體免疫和炎癥反應，并在腫瘤細胞凋亡等方面起作用［4］。涎腺ACC可很好地展示涎腺腫瘤細胞結構的復雜性，其不同分化類型表明其初始為一種惰性腫瘤，隨著NF-BP65等關鍵信號蛋白介導的信號通路的激活，其累積的能導致新突變的“土壤”足夠富于，ACC的產生、發展級別和危險度可能逐漸增加［5］。本研究觀察到NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT中的表達是存在差異的，提示NF-BP65與ACC是有關的，但與PA相比，發現NF-BP65的表達還是明顯高于PA。提示NF-BP65在兩種病變中的表達強度和數量存在差異，這與病變所處階段和嚴重程度一致。

研究證實許多腫瘤中凋亡相關基因表達異常，主要是抑凋亡基因表達上調，促凋亡基因表達下調［6］?？沟蛲龌駼Cl-2作為最重要的腫瘤細胞原癌基因之一，能阻斷細胞程序化死亡，延長細胞壽命，導致異常細胞的積聚，進而促進腫瘤細胞增殖，而且與腫瘤復發有關［7］。在某些未知的新信號通路的反復介入下，部分出現了特定的基因突變，如野生性P53和BCL-2基因變化。腫瘤逐步進展，發生惡變，這個過程長短不一，也可以一開始就出現ACC或其他惡性上皮性腫瘤。

圖1 NF-BP65在涎腺ACC中以胞漿表達為主，部分可見核漿共表達（Elivision法，×200）

圖2 NF-BP65在涎腺PA中表達定位于腺上皮胞漿，沿腺腔規則分布（Elivision法，×200）

圖3 BCL-2在涎腺ACC中的表達明顯增多，彌漫性分布（Elivision法，×200）

圖4 BCL-2在涎腺PA中的表達呈散在局灶表達（Elivision法，×200）

表1 不同組別NF-BP65的陽性表達情況

表2 不同組別BCL-2的陽性表達情況

表3 NF-BP65與BCL-2表達的相關性

圖5 NF-BP65表達與5年生存率

圖6 BCL-2表達與5年生存率

NF-BP65和BCL-2蛋白介入的兩種干預機制是否存在相關性，國內外文獻尚未給出明確答案，這也是本研究設立的初始動機。本文結果顯示NF-BP65與BCL-2表達呈正相關關系（=0.71，＜0.05），表明兩者與涎腺ACC中存在協同作用。NF-BP65可以通過對凋亡蛋白和抗凋亡蛋白不平衡表達的調節作用，實現抗凋亡功能。NF-BP65所介導的對自我吞噬作用的抑制效應，是其發揮抗凋亡作用的新機制［8］。

NF-BP65和BCL-2是否可以作為惡性腫瘤判斷預后的指標仍充滿爭議。尤金強等［9］則認為BCL-2蛋白表達強度越強，臨床預后可能越佳，這與本實驗結果是不一致的。而尹萬忠等［10］研究表明BCL-2蛋白表達僅與ACC的臨床分期正相關，但與預后無明顯相關，與本研究結果較為吻合。但通過生存曲線的觀察，筆者還是發現BCL-2陽性表達可能偏向具有較好的5年生存率，但數據否認了這種直觀印象，即使單因素P值為0.09已經接近差異性統計學標準。NF-BP65和BCL-2蛋白在改善ACC患者的預后可能有一定協同作用。由此導致的細胞周期延長可能會延緩細胞增殖，在生存曲線上則表現為非統計差異性曲線左移。

綜上所述，本研究結果證實NFBP65和BCL-2在涎腺ACC中有較高水平的表達，提示兩者與涎腺ACC發生和進展有關。此外，兩者可為鑒別涎腺ACC和涎腺實體型或篩狀結構的PA提供一定的參考依據。遺憾的是，NFBP65和BCL-2蛋白表達與涎腺ACC的預后無明顯相關性，間接驗證了單因素調節對預后影響的局限性。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.059

R734.2

A

1671-0800（2016）03-0393-03

2015-05-18

（本文編輯：陳志翔）

浙江省衛生廳一般項目（2012KYB188）

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陳昌暉，Email：ccchzr91@ 163.com