運(yùn)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)診斷非綜合征性耳聾基因變異

劉維強(qiáng) 張慧敏 余國(guó)就 孫筱放

·論著·

運(yùn)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)診斷非綜合征性耳聾基因變異

劉維強(qiáng) 張慧敏 余國(guó)就 孫筱放★

目的評(píng)價(jià)全外顯子組測(cè)序（whole-exome sequencing，WES）技術(shù)在非綜合征性耳聾患者基因變異診斷臨床應(yīng)用的可行性。方法利用Illumina Hiseq2000平臺(tái)對(duì)15例耳聾患者標(biāo)本進(jìn)行全外顯子捕獲測(cè)序，重點(diǎn)關(guān)注80個(gè)耳聾相關(guān)基因的序列捕獲效率及變異檢測(cè)情況并運(yùn)用常規(guī)測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果目標(biāo)區(qū)域（region of interested，ROI）20X以上平均覆蓋度為98％；在15份耳聾患者標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)致病性變異，涉及GJB2、SLC26A4、DSPP、TECTA和CHD7基因，其中，無(wú)義突變2個(gè)，移碼突變4個(gè)，剪切位點(diǎn)變異1個(gè)，其余為錯(cuò)義突變。經(jīng)常規(guī)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果一致。結(jié)論全外顯子組測(cè)序技術(shù)可快速可靠診斷非綜合征性耳聾患者基因變異。

全外顯子組測(cè)序；耳聾；變異

耳聾是最常見(jiàn)的人類感覺(jué)神經(jīng)疾病，其在兒童中的發(fā)病率可達(dá)1/1 000到1/300［1］。超過(guò)50％的遺傳性耳聾屬于感音性耳聾［2］，其中的70％為非綜合征性耳聾。耳聾是一種遺傳異質(zhì)性非常高的疾病，目前已明確的非綜合征和綜合征性耳聾基因已超過(guò)200個(gè)，并且仍有大量遺傳性耳聾致病基因尚不明確。雖然耳聾基因檢測(cè)并不能對(duì)治療產(chǎn)生直接幫助，但其對(duì)明確家系致病位點(diǎn)以及產(chǎn)前診斷都起著非常關(guān)鍵的作用，因此對(duì)耳聾致病基因的分子診斷有著重要的意義。

我國(guó)常見(jiàn)的耳聾致病基因?yàn)镚JB2、SLC26A4和12SrRNA，常見(jiàn)的檢測(cè)方法有基因芯片、熒光定量PCR法及Sanger測(cè)序等［3］。這些方法的局限是檢測(cè)位點(diǎn)少，成本高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，陽(yáng)性率低等。隨著下一代測(cè)序技術(shù)（nextgeneration sequencing，NGS）在臨床的廣泛應(yīng)用，基于全外顯子組和目標(biāo)序列捕獲的NGS方法已開(kāi)始應(yīng)用于耳聾基因變異的檢測(cè)［4-7］。本研究對(duì)15份經(jīng)常規(guī)9個(gè)熱點(diǎn)變異篩查陰性的耳聾患者標(biāo)本應(yīng)用全外顯子組捕獲測(cè)序，并設(shè)計(jì)目標(biāo)區(qū)域重點(diǎn)針對(duì)80個(gè)耳聾相關(guān)基因進(jìn)行變異分析。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象

15例病例標(biāo)本由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院友好提供。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)9個(gè)熱點(diǎn)變異篩查陰性。標(biāo)本采自診斷明確的具有聽(tīng)力障礙的患者，其中男9例，女6例，年齡1～6歲，平均年齡（3±1.4）歲。15例健康人標(biāo)本作為正常對(duì)照。

1.2 試劑和儀器

DNA提取方法采用DNeasy Tissue試劑盒（Qiagen，德國(guó)）。DNA打斷儀為Covaris S2系統(tǒng)（Covaris，美國(guó)），文庫(kù)建立采用美國(guó)Agilent公司Sure Select試劑，文庫(kù)質(zhì)檢使用Tape-Stations2200儀器檢測(cè)（Agilent，美國(guó)），測(cè)序試劑和儀器來(lái)自Illumina，美國(guó)。Sanger測(cè)序使用Applied Biosystems 3500基因分析儀（ThermoFisher，美國(guó)）。

1.3 基因組DNA質(zhì)量評(píng)估

使用Nanodrop儀（ThermoFisher，美國(guó)）檢測(cè)DNA濃度及純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序反應(yīng)

3μg基因組DNA經(jīng)Covaris S2系統(tǒng)打斷為200～300 bp大小片段，使用美國(guó)Agilent公司的SureSelect雙向測(cè)序試劑進(jìn)行文庫(kù)富集。750 ng文庫(kù)使用美國(guó)Agilent公司的SureSelect Human All Exon 50Mb試劑進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的捕獲。捕獲的文庫(kù)經(jīng)加標(biāo)簽混勻后利用美國(guó)Illumina公司的HiSeq2000測(cè)序儀90個(gè)循環(huán)全外顯子組測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Illumina測(cè)序儀自帶軟件CASAVA（1.8.2版本）拆分得到原始FASTQ文件。原始數(shù)據(jù)經(jīng)Trimmimatic軟件去掉接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)用BWA軟件比對(duì)到人參考基因組hg19（http：//genome.ucsc.edu/）上進(jìn)行初步分析。原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成FASTA文件后導(dǎo)入NextGeNe軟件（Softgenetics，美國(guó)）及生成VCF文件后再導(dǎo)入wannovar（http：//wannovar.usc.edu/）網(wǎng)站進(jìn)行注釋分析。

1.6 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

對(duì)NextGeNe和wannovar軟件發(fā)現(xiàn)的致病性變異利用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)目的基因進(jìn)行外顯子的引物設(shè)計(jì)，PCR及產(chǎn)物純化后上Applied Biosystems 3500基因分析儀（ThermoFisher，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果采用Mutation Surveyor進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)

所有DNA濃度均介于150 ng/μL～200 ng/μL間，A260/A280比值介于1.8～2.0間，質(zhì)量合格。

2.2 文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)

文庫(kù)質(zhì)量經(jīng)Tape-Stations儀器檢測(cè)，片段大小、濃度均符合要求，所建文庫(kù)片段大小介于315 bp左右。左邊峰及最右邊峰為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量品，大小為25 bp和1 500 bp，中間峰為待檢文庫(kù)片段，平均大小為315 bp，見(jiàn)圖1。

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將原始測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)格式轉(zhuǎn)換導(dǎo)入NextGeNe軟件進(jìn)行處理，各標(biāo)本的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)與基因組參考序列比對(duì)得到有效讀數(shù)介于3兆到6兆。其中80個(gè)耳聾基因目標(biāo)區(qū)域的有效測(cè)序深度及測(cè)序覆蓋度如表1所示。測(cè)序數(shù)據(jù)的分布具有較好的隨機(jī)性，雙向測(cè)序數(shù)據(jù)比接近1∶1，不存在偏倚性（圖2）。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)一攬表Table 1 Statistic of NGS data

2.4 變異檢測(cè)情況及功能預(yù)測(cè)

通過(guò)軟件自動(dòng)分析及數(shù)據(jù)過(guò)濾，本研究在15份耳聾患者標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)致病性變異，除了涉及GJB2、SLC26A4 2個(gè)常見(jiàn)基因外，還在DSPP、TECTA和CHD7 3個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了變異。在這些變異中含無(wú)義突變2個(gè)，移碼突變4個(gè)，剪切位點(diǎn)變異1個(gè)，其余為錯(cuò)義突變。變異位點(diǎn)見(jiàn)表2。對(duì)變異可能對(duì)蛋白功能產(chǎn)生的影響經(jīng)mutationtaster等在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

2.5 變異驗(yàn)證

Sanger測(cè)序證實(shí)全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的變異結(jié)果正確，見(jiàn)圖4。

3 討論

我國(guó)常見(jiàn)的耳聾致病基因?yàn)镚JB2、SLC26A4和12SrRNA，其中9個(gè)變異位點(diǎn)是中國(guó)人群耳聾基因變異熱點(diǎn)，包括GJB2基因的4個(gè)變異c.35delG、c.176del16、c.235delC、c.299-300delAT，GJB3基因的一個(gè)變異c.538C＞T，SLC26A4基因的2個(gè)變異位點(diǎn)c.IVS7-2A＞G、c.2168A＞G和線粒體m tDNA 12SrRNA的2個(gè)位點(diǎn)1555A＞G、1494C＞T。雖然對(duì)以上熱點(diǎn)變異運(yùn)用基因芯片等技術(shù)可以進(jìn)行變異的快速篩查，但由于耳聾基因的高度異質(zhì)性，與耳聾相關(guān)的基因目前已超過(guò)200個(gè)，因此這種熱點(diǎn)篩查的方法仍可能導(dǎo)致很大一部分耳聾患者不能明確基因變異情況。

近年來(lái)NGS技術(shù)已開(kāi)始應(yīng)用于遺傳性耳聾致病基因的研究［5，8-9］。運(yùn)用NGS技術(shù)，一些新的耳聾致病基因和位點(diǎn)也不斷被發(fā)現(xiàn)［5，10］。目前運(yùn)用較多的NGS測(cè)序是目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序或在全外顯子水平進(jìn)行變異位點(diǎn)的檢測(cè)。目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)可重點(diǎn)關(guān)注與耳聾等疾病密切相關(guān)的十幾個(gè)或幾十個(gè)基因，而全外顯子組測(cè)序則更有助于在所有蛋白編碼基因序列及其附近非編碼區(qū)找到罕見(jiàn)或新發(fā)變異。本研究前期對(duì)100多份耳聾病例進(jìn)行了常規(guī)變異熱點(diǎn)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)仍有近一半病例未能找到明確的致病變異。對(duì)其中15個(gè)病例常規(guī)檢測(cè)陰性的標(biāo)本我們進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序。雖然從經(jīng)濟(jì)成本考慮，目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)相對(duì)更有優(yōu)勢(shì)，但為了避免遺漏可能的罕見(jiàn)新發(fā)變異，本研究嘗試運(yùn)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。為方便數(shù)據(jù)分析，本研究設(shè)計(jì)了80個(gè)耳聾相關(guān)基因的興趣區(qū)域。

表2 耳聾基因變異檢測(cè)情況Table 2 Functionalprediction of the identified variants

對(duì)全外顯子組數(shù)據(jù)分析是發(fā)現(xiàn)變異的關(guān)鍵。通常一份標(biāo)本的全外顯子組測(cè)序結(jié)果一般可發(fā)現(xiàn)2萬(wàn)到5萬(wàn)個(gè)變異［11］，因此從如此眾多的變異中找尋到與耳聾密切相關(guān)的變異非常困難。本研究首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，將單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組等數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的頻率大于3％的多態(tài)性變異過(guò)濾，然后通過(guò)查詢文獻(xiàn)，并重點(diǎn)關(guān)注80個(gè)耳聾相關(guān)基因的興趣區(qū)域進(jìn)行軟件自動(dòng)查對(duì)，再通過(guò)生物信息網(wǎng)站如mutationtaster、SIFT和Polyphen-2對(duì)變異進(jìn)行功能預(yù)測(cè)［12-14］。通過(guò)以上方法，本研究在GJB2、SLC26A4、DSPP、TECTA和CHD7等基因發(fā)現(xiàn)變異，除無(wú)義突變，移碼突變等明確導(dǎo)致疾病的變異外，其他大部分變異均為錯(cuò)義突變。由于對(duì)錯(cuò)義突變的預(yù)測(cè)運(yùn)用不同的預(yù)測(cè)軟件可以有不一致的結(jié)果，有些軟件認(rèn)為變異致病而另一些軟件則認(rèn)為是多態(tài)性，所以會(huì)給數(shù)據(jù)分析帶來(lái)一定的困惑。在本研究中，為避免這種情況，我們聯(lián)合運(yùn)用前文所述的3種生物功能預(yù)測(cè)軟件來(lái)對(duì)同一個(gè)錯(cuò)義變異進(jìn)行聯(lián)合分析。當(dāng)3種軟件均認(rèn)為是致病或可能致病時(shí)才保留下來(lái)進(jìn)行后續(xù)分析。另外對(duì)變異是否致病我們同時(shí)還對(duì)位點(diǎn)的保守性進(jìn)行評(píng)估，當(dāng)變異發(fā)生在高度保守區(qū)時(shí)則格外關(guān)注。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)中國(guó)人群耳聾基因變異仍是以GJB2、SLC26A4為主。盡管如此，我們也只在2個(gè)病例中發(fā)現(xiàn)了常見(jiàn)的35delG變異，并且這2個(gè)病例如果運(yùn)用常規(guī)方法只能找到一個(gè)雜合變異位點(diǎn)，容易導(dǎo)致診斷錯(cuò)誤，另外的大部分變異如果用常規(guī)方法不能檢出，證實(shí)常規(guī)熱點(diǎn)篩查方法的確存在局限性。本研究發(fā)現(xiàn)4號(hào)病例DSPP基因的2個(gè)變異，文獻(xiàn)報(bào)與DSPP基因變異與遺傳性牙本質(zhì)發(fā)育不全相關(guān)［15］，而此病也可伴有耳聾表型［16］，考慮到本病例變異一個(gè)是無(wú)義變異，另一個(gè)是移碼突變，而這2個(gè)變異均可導(dǎo)致蛋白編碼提前終止，因此我們認(rèn)為這2個(gè)雜合變異可能為可能致病性變異，但仍需進(jìn)行后續(xù)的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。另外對(duì)12號(hào)病例我們?cè)赥ECTA基因發(fā)現(xiàn)2個(gè)雜合變異，通過(guò)檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)明確致病報(bào)道，但對(duì)其可能影響蛋白的功能預(yù)測(cè)及保守性分析后我們認(rèn)為此變異為可能致病性變異。

總之，本研究運(yùn)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)快速診斷出耳聾患者的多個(gè)致病變異，證實(shí)全外顯子組測(cè)序技術(shù)在耳聾變異診斷中的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)耳聾致病基因的分子診斷，聯(lián)合運(yùn)用熱點(diǎn)變異篩查和全外顯子或目標(biāo)區(qū)域基因組合測(cè)序?qū)⒂兄诎l(fā)現(xiàn)潛在的致病變異位點(diǎn)。隨著NGS在大樣本耳聾基因變異檢測(cè)中的應(yīng)用，此技術(shù)將體現(xiàn)出越發(fā)明顯的優(yōu)勢(shì)。

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Identification of gene variations in patients with nonsyndromic deafness by using whole-exome sequencing method

LIU Weiqiang，ZHANG Huimin，YU Guojiu，SUN Xiaofang★
（Key Laboratory for Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes，Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province，Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510150）

Objective To assess the efficiency of clinical genetic diagnosis of patients with nonsyndromic deafness by using whole-exome sequencing（WES）method.Methods WESwas performed using the Illumina Hiseq2000 platform in 15 patients with non-syndromic deafness.In this study，we designed a panel containaining 80 deafness genes for variant identification.A ll variants detected by WES were validated by Sanger sequencing.Results The coverage of the region of interest（ROI）over 20X reads was above 98％；pathogenic or likely pathogenic mutations were identified in different genes，such as GJB2，SLC26A4，DSPP，TECTA and CHD7.Among these variations，2 were nonsense mutations，4 were frame shift mutations，1 was a splice site mutation and the remaining were missense mutations.All variants were validated by Sanger sequencing.Conclusion The whole-exome sequencing method has provided a powerful tool to discover rare variations or novel genes in patients with non-syndromic deafness.

Whole-exome sequencing；Deafness；Variants

國(guó)家自然科學(xué)基金（31171229）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（A2015327）；廣東省科技廳基金（2013B051000087；2014A020212354）；廣州市科技局基金（201400000004-4；201400000003-4）；廣州醫(yī)科大學(xué)留學(xué)回國(guó)人員基金（2013C56）

廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東，廣州510150

★通訊作者：孫筱放，E-mail：xiaofangsun@gzhmu.edu.cn