克雅病的分子診斷

羅生輝 蔡繼勇

·綜述·

克雅病的分子診斷

羅生輝 蔡繼勇★

克雅病（creutzfeldt-jakob disease，CJD）是一種神經系統退行性疾病，臨床少見，其早期診斷較困難。目前診斷CJD的分子手段有3種：免疫組織化學、基因檢測及腦蛋白標志物。免疫組織化學法發現異常朊蛋白是確診的金標準，但是很大部分患者生前無法接受腦組織的免疫組織化學檢查；基因檢測可對CJD的分型及家族性CJD的診斷提供依據，但不是所有朊蛋白基因突變均會導致CJD；腦蛋白標志物的檢測在臨床上較實用，但所有腦蛋白標志物均有特異性的缺陷。本文旨在總結CJD在分子水平上的研究結果及進展。

克雅病；朊蛋白；朊蛋白基因；14-3-3蛋白；Tau蛋白

克雅病（creutzfeldt-jakob disease，CJD）是人類最常見的朊蛋白病，為神經系統退行性疾病，病理基礎是神經細胞的朊蛋白空間構象發生變異，出現一種可自我復制并對蛋白激酶抵抗的異構體。該病臨床分為散發性CJD、遺傳性CJD、醫源性CJD 3種。散發性CJD是最常見的類型，約占人類所有朊蛋白病的85％，年發病率在（1～2）/1 000萬［1］。該病表現為快速進行性的認知功能障礙、肌陣攣、視覺障礙、小腦性共濟失調、錐體束和錐體外系征、無動性緘默等。分子水平的檢查在CJD的診斷中起到決定性的作用，腦組織病理檢查是確診的金標準。但是在我國，大部分患者在生前無法接受病理檢查，死后家屬愿意接受尸檢的也很少。朊蛋白基因檢測可解釋CJD的臨床表現及個體對異常朊蛋白的易感性，腦蛋白標志物的檢測是臨床常用的診斷CJD的依據之一。本文將從蛋白質、蛋白標志物和基因3方面總結CJD在分子水平的診斷進展。

1 異常朊蛋白檢測

正常腦組織存在少量的朊蛋白（normal cellular isform of the prion protein，PrPc），是一種單基因編碼的膜結合性糖蛋白，呈α螺旋結構。異常的朊蛋白（protease-resistant prion protein，PrPsc）為朊蛋白的異構體，呈β片狀結構，CJD是PrPsc在腦內沉積所致［2］。

1.1 從腦組織中檢測

異常朊蛋白主要沉積在患者的腦組織中，取活檢或尸檢患者的腦組織，勻漿后用蛋白酶K（proteinase K）消化，異常朊蛋白不能被蛋白酶K完全消化，用酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）或蛋白免疫印跡雜交（Western blot）等方法檢測消化后的產物，若仍有朊蛋白，就可以診斷為朊蛋白病［3］。有學者［4］應用構像依賴性免疫測定（conformation-dependent immunoassay，CDI）方法檢測CJD患者的異常朊蛋白，發現異常朊蛋白在人體內的分布是不均勻的，并且有可能存在對蛋白酶K敏感的異常朊蛋白。

1.2 從外周組織中檢測

外周組織取材較容易，損傷小，因此從外周組織檢測異常的朊蛋白是很好的研究方向。Rubenstein等［5］總結了異常朊蛋白在人體中的分布，發現不論是散發性CJD還是變異性CJD，異常朊蛋白的水平在非中樞神經系統的人體組織（脾，淋巴結，扁桃體）沒有顯著差異。但是從外周組織中檢測朊蛋白的檢出率低，應用于臨床檢測還需進一步研究。

雖然腦組織病理檢查是金標準，但是腦組織標本不易獲得，臨床上很難實行，導致很多患者無法被早期診斷；外周組織雖然容易取材，但診斷的陽性率較低。

1.3 從體液中檢測

比外周組織更易獲得的是患者的體液或外周組織的刷洗液。在臨床上，血液、尿液、唾液、腦脊液等體液較容易獲得。如果能利用體液檢測異常朊蛋白，可極大的方便CJD的早期診斷，但是異常朊蛋白在這些體液中的含量均很低，利用專統方法檢測的敏感性很差，因此很多學者應用許多方法提高檢測的敏感性。研究者［6］運用共聚焦雙色熒光關聯分光鏡法（confocal dual-color fluorescencecorrelation spectroscopy，dual-color FCS）從CJD患者腦脊液中檢測到了PrPsc。隨著技術的發展，各種新的方法也被利用，利用朊蛋白錯誤折疊循環擴增技術（protein m is folding cyclic amplification，PMCA）可從臨床前期的綿羊口腔分泌物中檢測出異常的朊蛋白［7］，近幾年實時震動誘導轉化（real-time quaking-induced conversion，RT-QUIC）技術也顯示出很大的應用價值。2011年，Atarashi等［8］首次報道應用RT-QUIC技術擴增檢測異常的朊蛋白，從而提高了應用腦脊液檢測異常朊蛋白的敏感性。而后也有研究者［9］應用該技術獲取CJD患者的鼻黏膜刷洗液檢測異常的朊蛋白，獲得很高的靈敏度及特異度（靈敏度97％，特異度100％）。而Peden等［10］的研究表明，應用該方法檢測散發性CJD患者的腦脊液有很高的敏感性，但是對變異性CJD敏感性不高。

但是，異常朊蛋白在體液中的含量低，利用各種擴增的方法雖然可提高檢測的敏感性，但不可避免的會出現假陽性的情況。因此，要將上述檢測方法應用到臨床尚需經過大宗樣本的檢測，確定有較好的特異性和可重復性之后方可應用。

2 腦蛋白標志物檢測

異常朊蛋白是朊蛋白病的特異性蛋白，臨床上檢測到異常朊蛋白是確診朊蛋白病的必要條件。異常朊蛋白的檢測較困難，研究者們試圖找到可代替異常朊蛋白的腦蛋白標志物。

2.1 14-3-3蛋白和Tau蛋白檢測

14-3-3蛋白在神經系統中含量最豐富，約占全部可溶性蛋白質的1％，所有神經細胞的胞液與胞核中都有表達［11］。Tau蛋白主要在中樞神經系統神經元的軸突表達，存在于星形膠質細胞和少突膠質細胞內，在外周神經系統的神經元軸突也有表達。

1998年的世界衛生組織將14-3-3蛋白列入診斷CJD的標準，但14-3-3蛋白在不同分子亞型中變異很大，129密碼子基因型、朊蛋白類型、疾病所在分期、臨床亞型均會影響14-3-3蛋白含量和檢測的敏感性［12］，且14-3-3蛋白在特異性方面也有缺陷。近年來有許多研究發現Tau蛋白優于14-3-3蛋白，Ham lin［13］和Tagliapietra等［14］對MRI、14-3-3蛋白和Tau蛋白的對比發現，Tau蛋白的敏感性和特異性優于14-3-3蛋白。在遺傳性CJD的研究中，以色列研究人員［15］發現，Tau蛋白與14-3-3蛋白在敏感性方面沒有區別，但Tau蛋白的特異性更高。中國疾病預防控制中心的研究員曾對200例很可能的CJD患者的腦脊液分析發現，CJD患者腦脊液Tau蛋白升高，以腦脊液Tau蛋白含量1 400 pg/m L為分界點，其診斷CJD的敏感性是90％，特異性是94％［16］。

2012年美國的指南仍推薦14-3-3蛋白作為散發性CJD的診斷標志物［17］，Tau蛋白是否能取代14-3-3的蛋白地位還沒有結論，但研究表明聯合檢測這2種標志物可提高敏感性及特異性［18］。

2.2 胸腺素β4蛋白

研究者［19］通過檢測21例病理確診的CJD患者的腦脊液的胸腺素β4蛋白，發現用其診斷CJD的靈敏度為100％、特異度為98.5％。然而該標志物的應用價值仍需進一步研究。

2.3 其他蛋白標志物

S100蛋白及神經元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）等蛋白標志物由于特異性差，已沒有研究價值。一些標志物如心型脂聯合蛋白（heart-type fatty acid binding，H-FABP）［20］、細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）［21］、泛素（ubiquitin）［22］有待進一步研究。

腦脊液蛋白標志物的檢測是目前CJD診斷必要檢查，也是曾經研究的熱門，但特異性差是該類蛋白標志物共有的缺點，隨著外周組織及體液異常朊蛋白檢測技術的深入研究，腦脊液蛋白標志物的檢測在CJD的診斷中的地位也將動搖。

3 基因檢測

正常的朊蛋白由位于第20號染色體短臂上的朊蛋白基因（prion protein gene，PRNP）編碼［23］。腦組織出現PrPSc的原因有自身PRNP突變、PRNP翻譯錯誤或感染了外源的PrPSc所致。人類PrP基因存在著多態性，它影響人類對于散發性、遺傳性或是醫源性CJD的易感性。129位點純合子較雜合子更易感染朊蛋白。不同位點的基因突變會導致不同類型的CJD，其臨床表現也不一樣。

3.1 散發性CJD檢測

散發性CJD約占人類朊蛋白病的85％［1］。散發性CJD有不同的臨床變異型。在CJD的臨床癥狀和體征、異常朊蛋白的物理化學特征、異常朊蛋白在腦內損害的部位和沉積的形式上，不同臨床表型有不同表現，表型的不同在很大程度上取決于PrP基因129密碼子位點上甲硫氨酸（methionine，M）和纈氨酸（valine，V）的多態性和異常朊蛋白的分子量。根據朊蛋白的糖基化程度不同可有2種分子量：第1種分子量為20（20.5±0.3）kD，為朊蛋白株1型（type 1）；第2種分子量為19，（18.7± 0.2）kD為朊蛋白株2型（type 2）。有學者［24］根據PrP基因129位點密碼子的多態性和異常朊蛋白的物理化學特征，把散發性CJD分成6型。研究表明，219密碼子的多態性與CJD無明顯作用［25］。3.2遺傳性CJD檢測

遺傳性CJD占CJD的5％～15％［1］，是常染色體顯性遺傳病，通常都有CJD的遺傳史，與20號染色體短臂上的PrP基因突變相關。其中最常見的疾病相關突變是第102位密碼子和第200位密碼子突變。目前發現的，國外學者報道的可導致CJD的突變位點有178、129、183、211、180，國內學者有報道114、180、196、203密碼子突變的家族［26-29］，擴大了CJD的PRNP基因突變譜。

3.3 醫源性檢測

是由于患者接受了醫學治療后感染異常朊蛋白所致，醫源性途徑主要有角膜移植、硬腦膜移植、注射人生長因子及促性腺激素以及使用被污染的深部電極等［30］。在對41例因注射受污染的人類生長激素或促性腺激素后患CJD的患者進行朊蛋白基因129密碼子的分析中發現，21例是129密碼子甲硫氨酸純合子，17例為纈氨酸純合子，3例是甲硫氨酸/纈氨酸雜合子；12例與硬腦膜移植有關的CJD病例的129密碼子全部是甲硫氨酸純合子［31］。結果表明，129密碼子是純合子更易感染異常朊蛋白。

4 小結與展望

由于CJD的發病率低，國內神經科醫生對CJD的了解不足，CJD的診斷率不高。隨著國內神經科醫生對該病的認識不斷加強，CJD的診斷率也會增加。在診斷CJD的腦脊液神經蛋白質中，14-3-3蛋白是最有價值的腦神經蛋白；腦組織病理檢查及異常朊蛋白的檢測敏感性及特異性最好，但取材困難；外周組織及體液取材容易，但檢測的敏感性差。隨著技術的進步，體液及外周組織的刷洗液的異常朊蛋白檢測有可能在CJD的早期診斷中起到至關重要的作用。

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The molecular diagnosis of creutzfeldt-jakob disease

LUO Shenghui，CAIJiyong★
（Department of Neurology，The First Hospital of Fuzhou City（the Affiliated Hospital of Fujian Medical University），Fuzhou，Fujian，China，350009）

Creutzfeldt-jakob disease（CJD）is a rare neurodegenerative disorder.The diagnosis of it is extremely difficult in its early stages.There are 3 diagnostic methods at the molecular level: immunohistochemistry，gene detection，and measurement of brain protein biomarkers.A definite diagnosis of CJD is obtained following the demonstration of the pathologic prion isoform in brain tissues，but a substantial proportion of the cases are not subjected to neuropathology.Although gene detection can provide a basis for the typing and the diagnosis of CJD，not all of the prion protein gene mutation will lead to CJD.The detections of brain protein biomarkers are relatively practical clinically，but all of the brain protein markers are with specific defects.In this paper，the research results and progress of CJD at the molecular level will be summarized.

Creutzfeldt-jakob disease；Prion protein；Prion protein gene；14-3-3 protein；Tau protein

福建醫科大學附屬福州市第一醫院神經內科，福建，福州350009

蔡繼勇，E-mail：15736973@qq.com