下一代測序（NGS）技術的發展及在腫瘤研究的應用

邵向陽 徐偉文

·述評·

下一代測序（NGS）技術的發展及在腫瘤研究的應用

邵向陽 徐偉文★

下一代測序（next-generation sequencing，NGS）由于高靈敏度、高通量、高度自動化等特性，近年來在疾病的研究和診斷治療中越來越多地被應用。下一代測序技術的發展為腫瘤分子生物學的研究提供了新的手段。本文就下一代測序技術的種類、特點、發展趨勢及其在腫瘤研究中的應用作簡要的綜述。

下一代測序（NGS）；腫瘤；精準醫療

隨著分子生物學技術的不斷發展，人類對生命現象和疾病的研究已經不再局限在單個基因位點，而是將目光集中于全基因組方面。Sanger測序法是科學研究和臨床實驗室里首選的測序金標準技術［1］，人類基因組計劃就是依靠Sanger測序法才得以完成的［2］。隨著技術革新，DNA測序技術得到了不斷的創新，在保證測序準確度的前提下，逐步優化操作程序，使得測序速度逐漸提高，測序成本也呈下降趨勢，下一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）就應運而生，并在隨后得到突破性進展。《Nature Methods》在2007年評選的生物領域影響力最大的技術中，NGS技術以高票當選［3］。與Sanger測序技術不同，NGS技術通過反復測序同一區域的DNA片段，達到更高的靈敏度和準確度，同時通量高、自動化程度高，可在短時間內完成對上百億堿基的測序［4］，使得在幾天內完成人類全基因組測序成為可能［5-7］。也正因為NGS技術的高準確度、高速度以及低成本，對推動分子生物學的發展起到了重要作用，為腫瘤分子生物學的研究提供了新的手段，尤其在腫瘤分子診斷領域更是占有更重要的地位。

1 二代測序技術簡介及特點

2005年世界上首臺新一代測序儀問世，并且很快就被應用到了如火如荼的分子生物學領域當中。NGS技術，并不是某種單一的技術，而是一個技術群。不同的NGS平臺，在其原理上有所不同。基本的原理都是在DNA進行PCR擴增時，借助一些化學標志物在堿基插入DNA鏈時發出的信號來讀取序列信息，信號可以是光信號，也可以是H+流信號（H ion fluxes）。

1.1 Roche/454［5］

454公司開創了邊合成邊測序的先河，后期又推出了GSFLX系統，主要采用焦磷酸測序（pyrosequencing）原理（圖1［8］）。

GS FLX系統的流程概括起來，就是“一個片段=一個磁珠=一條讀長（one fragment=one bead= one read）”。“一個片段=一個磁珠”是指長度為300～800 bp的DNA片段與接頭（3’和5’端具有特異性）連接，帶有接頭的單鏈DNA片段構成樣本文庫，特別設計的DNA捕獲磁珠固定單鏈DNA文庫，每一個磁珠只能與一種獨特的單鏈DNA片段結合。隨后把結合DNA片段的磁珠和PCR擴增試劑的水溶液注入到礦物油中，形成油包水混合物，這樣就形成只包含一個結合DNA片段的磁珠和PCR擴增試劑的微反應器。乳液PCR在各自的微反應器里獨立擴增，排除其他污染性和競爭性的影響。每一個片段經擴增后產生幾百萬個相同的拷貝，乳液混合物被打破后，擴增片段仍結合在磁珠上。“一個磁珠=一條讀長”是指將捕獲DNA的磁珠放入PTP板中進行測序反應，PTP板只能容納一個磁珠。將PTP板放在GS FLX中4種堿基依次按照T、A、C、G的順序循環進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發生堿基配對就會釋放一個焦磷酸，這個焦磷酸在ATP硫酸化酶（adenosine triphosphate-sulfurylase）和熒光素酶的作用下，經反應，最終把熒光素氧化形成氧化熒光素，同時產生光信號，被電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）光學系統捕捉一個特異的檢測峰值，依據峰值即可讀出準確的DNA序列信息［9］。每個磁珠都產生一條讀長，通過GSFLX系統分析，最后得出樣本的DNA序列信息。

焦磷酸測序法的準確率在99％以上。主要錯誤類型是插入-缺失，而不是替換，是因為相同堿基的連續插入，沒有終止原件阻止單個循環的連續插入，相同堿基的長度需從信號強度中推斷出來，在這過程就可能產生誤差。

1.2 Illumina/Solexa［10］

Illumina公司的二代測序儀Genome Analyzer最早是由Solexa公司研發的，其核心專利技術是“DNA簇”和“可逆性末端終結（reversible terminator）”。其原理（圖2［8］）是：將基因組DNA經超聲波打斷成幾百bp甚至更小的片段；然后進行末端修復補平加堿基A；再加上接頭（adapter）制備成文庫。將樣本文庫加入到專利的芯片（flowcell）上，芯片表面種植了通過共價鍵鏈接2種與接頭互補的寡核苷酸引物。文庫經變性變成單鏈，其一端與芯片一種引物結合固定，另一端隨機與附近的另一個寡核苷酸引物互補固定，形成單鏈橋狀結構；并且以周圍的寡核苷酸引物為擴增引物，在芯片上進行擴增，形成2條鏈。雙鏈再次變性成單鏈，繼續上述PCR過程擴增，這就是所謂的橋式PCR擴增。連續重復上述過程，待測DNA數量就會以指數方式增長，形成DNA簇。“可逆性末端終結”是指在測序過程中，使用“可逆終止子”進行邊合成邊測序。“可逆終止子”是帶有熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），但在3′-羥基端帶有可被化學切割的基團，這些基團能夠封閉dNTP的3′端黏性，阻止另一個dNTP與之相結合。使得每一步反應只能延伸一個堿基，采集完熒光信號，熒光基團去除，封閉基團被去掉，進行下一步反應，每步收集的熒光信號，對應所檢測的序列。如此反復，得出片段的精確序列。

Genome Analyzer測序原理采用穩定的可逆終止法邊合成邊測序技術，該技術使用4種含有末端阻斷基團和不同熒光信號的堿基進行模板互補鏈的合成，不僅確保了測序的高精確性和高順序性，而且排除了由重復序列和同聚物導致的測序錯誤。

1.3 Life/SOLiD［11］

SOLiD應用連接法測序，同時利用了獨特的雙堿基編碼原理。以連接反應代替了傳統的聚合酶連接反應。SOLiD測序在文庫構建和PCR擴增方面，與GS FLX系統很類似，都是通過磁珠接頭捕獲待測DNA片段，然后進行乳液PCR。SOLiD的磁珠只有1μm，比GS FLX系統的磁珠小的多。SOLiD連接反應的底物是長度8 bp的特殊單鏈熒光探針，其3’端第1、2位構成的堿基對是表征探針染料類型的編碼區，5’末端被標記4種熒光染料，因此不同的序列組合就被標記上不同的熒光基團。單向SOLiD測序包括5輪測序反應，每輪反應由多個連接反應構成，探針與測序引物相鄰近的序列雜交，用顏色判斷堿基序列，讀取信號。然后通過化學方法在第5和第6位之間切割，把熒光信號淬滅，以進行下個位置的測序。第一次連接反應實際上連接上了5個堿基，通過這種方法，每次測序的位置都相差5位，即第一次測1和2位，第2次測6和7位……在測到末尾后，依次類推，進行第2輪連接反應；由于第2輪測序比第一輪測序往前移動了一個堿基，得到0～1位、5～6位……的熒光信息，5輪反應后，測出全部位置并且每個位置都被檢測了2次。

SOLiD測序技術在測序過程利用了獨特的雙堿基編碼原理，能對測序錯誤進行校正，減少原始數據錯誤。以連接反應代替了傳統的聚合酶連接反應能明顯減少因堿基錯配而出現的錯誤，在測序過程中更換引物也能減少背景噪音和錯誤率。目前SOLiD系統聲稱其原始堿基數據的準確度大于99.94％，而且SOLiD 4系統將再度升級。SOLiD 4 HQ package將使每次運行產生300GB可定位的序列數據，并帶來99.99％的準確率［12］。

1.4 Ion Torrent測序平臺

Ion Torrent的核心技術是使用半導體技術在化學和數字信息之間建立直接的聯系。Ion torrent的基本原理是：把DNA鏈固定在半導體芯片的微孔中，隨后依次摻入ACGT堿基。隨著每個堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個孔底部時能被檢測到，通過對H+的檢測，實時判讀堿基。具體過程是：將待測DNA片段2端加上Ion Torrent測序接頭制備成DNA文庫。將文庫克隆到離子微球顆粒上并進行乳液PCR擴增。將含有擴增模板的離子微球顆粒加入到半導體芯片上，測序時一個個堿基連續流過芯片微孔。如果堿基與特定微孔中的DNA分子互補，則該堿基被合成到DNA分子中，DNA鏈每延伸一個堿基時，就會釋放一個質子（H+），導致局部pH發生變化。離子傳感器檢測到pH變化后，即刻便從化學信息轉變為數字電子信息。如果DNA鏈含有2個相同的堿基，則記錄電壓信號是雙倍的。如果堿基不匹配，則無H+釋放，也就沒有電壓信號的變化。

Ion Torrent測序技術直接檢測DNA的合成，因少了CCD掃描、熒光激發等環節，幾秒鐘就可檢測合成插入的堿基，大大縮短了運行時間。通過對H+的檢測，明顯改善堿基判讀準確性，測序成本低；該系統無需光學檢測和掃描系統，無需標記熒光染料和化學發光的配套試劑，技術的讀長相對較短。但若單個堿基連續重復出現多次，會導致一個循環里產生大量的H+，引起pH值的劇烈變化，導致信號不準確。

1.5 華大基因CG測序平臺［13-14］

CG平臺擁有2種獨特的測序相關技術：DNA納米球芯片和組合探針錨定連接測序技術。DNA納米球芯片制備（圖3A）：由DNA片段和2個接頭組成DNA文庫。測序時接頭作為讀取起始位點，可從DNA與接頭連接處每次最多讀取10個連續堿基，然后單鏈環狀DNA分子通過滾環復制，形成一個包含200多個拷貝的DNA納米球。將建庫得到的DNA納米球采用高密度DNA納米芯片技術，加到芯片上的網狀小孔內，每個小孔只能容納一個DNA納米球，DNA納米芯片的占用量超過90％，每一個制備好的芯片可容納1 800億個堿基用于成像。組合探針錨定連接法（圖3B）：組合探針錨定連接法利用4種不同顏色標記的探針去讀取接頭附近的堿基，每次最多讀取10個連續堿基且每次測序是相互獨立的，在測序時，加入anchor與接頭互補配對，然后DNA連接酶將4種不同顏色標記的探針結合到模板的相應堿基上，通過對熒光基團的成像來判斷堿基類型。

表1 各測序平臺原理和優缺點Table 1 The principles，advantages and disadvantages of the sequencing platform

CG平臺采用高密度DNA納米芯片技術，在芯片上嵌入DNA納米球，然后用復合探針-錨定分子連接技術來讀取堿基序列。由CG開創的從頭拼接（local de novo）技術，可精確檢測等位基因雜合子突變，靈敏性高；采用組合探針錨定連接法技術來讀取堿基可明顯減少探針和酶的濃度。與邊合成邊測序不同，組合探針錨定連接法每個cycle可一次性讀取數個堿基，這樣消耗的測序試劑和成像時間都大大減少。每次測序都是相互獨立的，測序結果不受前一個堿基測序結果的影響，因此不會發生錯誤累積的現象。

以上5大技術產品平臺是目前NGS的主流。它們技術原理不盡相同，各有自己的優缺點（表1），在科研和臨床應用中發揮著重要的作用。

2 下一代測序技術在腫瘤研究中的應用

隨著人類基因組計劃的完成和測序技術的不斷發展，NGS技術不僅保持高準確度，而且大大降低了測序成本并極大地提高了測序速度，在醫學領域得到廣泛應用。尤其在腫瘤分子診斷領域（cancer molecular diagnostics）更是當仁不讓的主力軍。

2.1 NGS在血液腫瘤中的應用

自Ley等［15］在2008年首次報道了利用NGS技術對1例正常核型的急性髓細胞性白血病的基因組分析后，NGS就被廣泛應用于腫瘤領域。在2012年美國血液學會（American Society of Hematology，ASH）年會上關于測序（sequencing）的文獻共有643篇；其中，應用NGS的文章有220篇，涉及到急性白血病、骨髓增殖性疾病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、再生障礙性貧血、止血與血栓疾病等各類血液學疾患。對于一些臨床表現非常相似的血液病如免疫缺陷病（severe combined immunodeficient disease，SCID）、血小板功能失調癥，診斷變得很困難，傳統的細胞學檢測可能出現漏診。鑒于NGS技術的高通量、高靈敏等優勢，近幾年來被越來越多地用于血液病的臨床診斷治療中。Sanger測序的敏感度只有15％～20％，低于此頻率的突變檢測不到，而NGS可以檢測到低于1％的突變。由此看出，NGS相對于Sanger測序而言，能發現更多低頻率的突變。NGS能同時檢測多個基因，能更全面地了解腫瘤的分子遺傳學特征。對于一個腫瘤個體來講，其內部存在不同的亞克隆，這些克隆隨著疾病的進展及治療措施的干預會發生動態的變化。研究發現，腫瘤復發時突變的譜型會發生變化，有些是診斷時的主克隆群體產生了新的突變，而這些突變是原來的次要克隆攜帶的；有的是診斷時的次要克隆演變成主要克隆，此時次要克隆攜帶的突變變成了頻率較高的突變。因此各克隆群體在診斷、治療后和復發時的變化帶來的突變頻率的變化在檢測結果上就某一項突變而言，可能并無明顯差異，但這種沒有差異的表現并不能說明腫瘤內部克隆群體沒有發生變化。因此，要綜合所有的相關突變，以譜型的變化來判斷腫瘤的進展、治療的療效及疾病的預后，NGS在這方面變出明顯的優勢［16］。

2.2 NGS在循環腫瘤DNA檢測中的應用

1948年Mandel和Metais［17］在人體血液循環中發現游離DNA的存在，稱之為“Cell-free DNA”（cfDNA）。隨著研究的不斷深入，目前研究發現腫瘤患者的外周血中能檢測到游離核酸的存在［18］。這些游離核酸以基因組和線粒體DNA成分為主，也被稱為循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）［19］。腫瘤細胞主要通過被動和主動機制2種途徑來產生ctDNA。被動機制是腫瘤細胞壞死或者凋亡后，細胞中的DNA釋放進入循環系統，游離地存在于血液中［20］。主動機制則是指腫瘤細胞能主動釋放DNA到外周循環之中；腫瘤細胞分泌的外排體也可以產生ctDNA。研究發現，在人類很多惡性腫瘤中均能檢測到ctDNA如前列腺癌［21］、肺癌［22］、乳腺癌［23］、大腸癌［24］、肝癌［25］、膀胱癌［26］、宮頸癌［27］、胰腺癌［28］、卵巢癌［29］等。腫瘤的原發灶和轉移灶之間存在遺傳學、表觀遺傳學和轉錄組學的差異。利用外周血中的ctDNA能更準確、更高效評估腫瘤的進展，如果腫瘤細胞發生某種突變，這些突變可以在ctDNA中反應出來，通過NGS對ctDNA測序獲得突變信息，就獲得了腫瘤細胞的突變信息。2014年4月在《Nature Medicine》發表的一篇文章指出，將NGS技術應用于血漿ctDNA檢測，具有驚人的高特異性和敏感性。作者將此法命名為深度測序腫瘤個體化建檔法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）［30］。研究者對不同級別的肺癌患者進行了CAPP-Seq驗證，發現對II～IV期的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）檢測敏感性達100％，I期的NSCLC中敏感性為50％；對各期肺癌的特異性均為96％。以上結果顯示CAPP-Seq并不比金標準腫瘤活檢的診斷效能差，能夠準確測定肺癌的基因型。

研究發現，外周血中出現高頻的腫瘤相關基因突變如p53、KRAS和APC等，往往與較高的臨床分期有關，也預示著患者較差的預后；與腫瘤靶向治療、診斷及預后相關標記如K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等，通過NGS技術對ctDNA中這些的標記物進行測序，能夠更精確更全面地為腫瘤的靶向治療、藥效檢測和患者的預后評估提供依據［31-32］。

2.3 NGS在腫瘤風險預測及預防中的應用

NGS技術可使腫瘤防治措施前移至預防階段。大量研究表明某些腫瘤的發生與個別關鍵基因突變有密切關系。乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）變異被發現與女性的遺傳性乳腺癌和卵巢癌相關［33-34］。BRCA1/2基因是一類腫瘤抑制基因，可以幫助修復DNA損傷并能確保細胞的遺傳物質（DNA）的穩定性，防止細胞生長變異。但當BRCA1/2基因發生變異后，細胞失去了這一保護作用，發生癌變的風險將大大增加，并且還存在家族遺傳性。BRCA2基因變異與男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌發生同樣關系密切［35］。美國好萊塢女星安吉麗娜·朱莉的案例就是一個應用實例。乳腺癌高危人群基因篩選技術以及肺癌基因檢測技術已在臨床投入使用，國家腫瘤臨床醫學研究中心開展的乳腺癌基因檢測技術，是利用NGS測序技術就BRCA1、BRCA2等6個國際公認的乳腺癌易感基因，進行全外顯子基因測序檢測，用于預測乳腺癌發生的概率；對于遺傳性乳腺癌、卵巢癌和其他癌癥，2014版美國國立綜合癌癥網絡指南中明確指出可利用NGS技術檢測相關的基因突變。

2.4 NGS在單細胞測序中的應用

2014年，單細胞測序的應用被列為《自然-方法學》（Nature Methods）年度最重要的方法學進展。2015基因組學前沿研討會將單細胞組學單獨列為一個單元。常規的測序樣品來源大多數是多細胞的混合DNA，這種方法得到的全基因組序列信息是一群細胞基因信息的平均值，或其中占優勢數量的細胞信息，而單個細胞的特性和細胞與細胞之間的異質性則被忽視。單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序用于揭示細胞群體差異和細胞進化關系。但由于PCR擴增時存在偏倚，常導致測序結果的基因組覆蓋度很低。2012年，哈佛大學謝曉亮院士在《Science》發表了單細胞全基因組擴增新技術（multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC），即多次退火環狀循環擴增技術［36］。不同于以往的非線性或指數型擴增方法，MALBAC技術利用特殊引物，使得擴增子的結尾互補而成環，從而很大程度上防止了DNA的指數性擴增，從而解決了基因組擴增對微量初始模板過大的擴增偏倚，使得MALBAC擴增的DNA基因組覆蓋度達到93％，并使基因組測序的模板需求量從μg級降至單細胞水平。2012年，華大基因同樣利用單細胞測序技術對單個腎癌細胞的單核苷酸突變特征進行分析，從而在更高的分辨能力上為評價基因改變的復雜性提供了更為優化的方法。2014年，華大基因又利用該方法在結腸癌中發現了一個新的癌基因SLC12A5［37］。單細胞測序技術不僅為腫瘤分子分型和個體化治療提供指導，還將有助于我們理解腫瘤內部的異質性和腫瘤的演進［38］。單細胞測序技術還能與循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）篩選技術相結合，檢測外周血CTCs單核苷酸變（single-nucleo-tide variations，SNV）、CNV或外顯子組插入/缺失突變，為腫瘤診斷及個體化治療提供一種非侵入性檢測手段。

3 展望

個性化醫療是基于基因序列的分子診斷技術的發展而出現的，目前主要應用的技術是基因測序技術。基因測序技術被應用于個性化醫療，是因為個體化醫療是以每個患者的基因組信息為基礎決定治療方針，了解患者的整體遺傳信息，對預防、診斷、治療和用藥提供指導性意見。也因此出現了很多靶向治療藥物，這些藥物的用藥基礎依據患者的基因組及分子差異（變異），所以患者的基因組信息尤為重要，Sanger測序技術，可以用于個體化醫療，但是測序通量小，速度慢，靈敏度較NGS低，成本高，此時需要一種簡便、快捷、準確，同時成本又不太高的測序診斷技術就是NGS技術，憑借自身高靈敏度、高通量等特性被廣泛用于腫瘤個體化醫療和基因分子生物學的研究并帶來新的變化，在腫瘤分子生物學的研究以及臨床應用方面，也顯示了多方面的影響并推動了個體腫瘤學發展。NGS技術，在臨床診斷中應用，對腫瘤患者的疾病診斷和治療都起到巨大作用。近期提出的精準醫療，它是以個體化醫療為基礎，以環境、生活方式、既往病史及診療方式等為跟蹤對象，搜集全方位、可量化、有前瞻性和時效性的個體數據，通過數據的綜合分析、挖掘形成有價值的醫學信息，最終設計出針對個體的最優解決方案。在精準診斷方面，對人體了解需要更加深入到基因組、體細胞突變等，這些需要依靠測序技術，通過NGS技術能更精準更全面地了解患者的信息。NGS為個體提供連續基因大數據，是精準醫療的基礎和重要實現途徑。隨著技術的不斷革新，測序技術層出不窮。新的測序技術陸續出現，以單分子測序為特點的DNA測序技術已經出現，該測序技術不需要進行PCR擴增，消除了潛在的擴增錯誤和不均勻，測序長度更長速度更快。最近出現的納米孔測序技術，相比于前面3類測序技術，該測序技術是真正實現單分子檢測和電子傳導檢測相結合的測序方法，完全擺脫了洗脫和PCR擴增過程。納米孔測序技術一旦投入市場，將有望在幾小時內以幾百美元的成本完成全基因組測序。每一項新技術的出現都有超過前代技術的獨特之處，但是各代測序均有不足之處，Sanger測序的主要缺陷是低通量和高成本，NGS測序的缺陷是序列長度較短，DNA測序和納米孔測序在準確率方面尚存在嚴重缺陷。由于NGS技術面臨的短序列缺陷可以通過生物信息學工具在一定程度上進行彌補，因此NGS技術是現今最穩定，應用范圍最廣泛的測序技術。目前科學家正在通過減緩DNA序列通過納米孔速度的方式提高新測序的準確度，專家預計10年內新測序的準確度將會顯著提升，屆時將在保證測序通量的基礎上，憑借著超長序列讀長的優勢將逐步取代NGS測序。隨著基因測序通量、準確度的提高和成本的降低，相信測序技術，將在腫瘤分子生物學領域，提高腫瘤的診斷和治療水平方面發揮重要的作用。

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Advances in next-generation sequencing（NGS）technology and their application in cancer research

SHAO Xiangyang，XU Weiwen★
（School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Next-generation sequencing（NGS）platforms have recently evolved to provide an accurate and comprehensive means for the research and diagnosis of diseases.Advancements in next generation sequencing technology have provided a new way for the study of the molecular biology of tumors.In this review，the characteristics and developmental trends of next generation sequencing technology are summarized，and applications in tumor research are discussed.

Next-generation sequencing（NGS）；Tumor；Precision medicine

十二五國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2012AA020205）；廣州市產學研協同創新重大專項（201508020052）

南方醫科大學生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：徐偉文，E-mail：xu_sandy2006@126.com