牦牛乳硬質干酪苦味肽的分離與特征鑒定

宋雪梅，張 炎，楊 敏，梁 琪，*

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070）

牦牛乳硬質干酪苦味肽的分離與特征鑒定

宋雪梅1，2，張 炎1，2，楊 敏2，3，梁 琪1，2，*

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070）

為了探究牦牛乳硬質干酪中苦味肽組成特征，采用氯仿-甲醇法提取苦味肽，通過Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜進行分離純化，并利用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）對其分離的苦味較強組分進行特征鑒定。結果表明：經Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離得到3 個不同分子質量的組分，組分Ⅱ具有明顯苦味。LC-MS/MS鑒定出組分Ⅱ中存在14 種苦味肽，主要為氨基酸殘基數目7～17個、分子質量小于2 000 D的小肽，苦味肽序列中存在的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸，800～1 500 D苦味肽占64.29%，源自β-酪蛋白（β-casein，β-CN）降解產物的苦味肽占92.86%。因此，干酪成熟過程中源自β-CN的具有較強疏水性、分子質量小于2 000 D的混合多肽的積累可能對干酪苦味的產生有較大影響。

牦牛乳硬質干酪；苦味肽；特征；β-酪蛋白

宋雪梅， 張炎， 楊敏， 等. 牦牛乳硬質干酪苦味肽的分離與特征鑒定［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 160-164. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615027. http://www.spkx.net.cn

SONG Xuemei， ZHANG Yan， YANG Min， et al. Separation and characterization of bitter peptides from hard cheese made from yak milk［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 160-164. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615027. http://www.spkx.net.cn

在干酪成熟過程中，酪蛋白在凝乳酶、纖維蛋白溶酶、發酵劑蛋白酶和肽酶等作用下，逐漸降解成寡肽、小肽和游離氨基酸，但是成熟過程中發生不恰當降解時，干酪將產生苦味等缺陷。研究表明，酪蛋白降解產物——苦味肽對Cheddar干酪［1］、Ragusano干酪［2］等苦味的產生起了重要作用。

肽的苦味源自于肽的疏水性氨基酸如精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸，它們是苦味受體的結合位點［3］。多肽中的疏水性氨基酸不像完整蛋白質分子被包藏在內部，而是暴露在外，當接觸味蕾時，就會產生苦味。疏水性氨基酸側鏈暴露越多，多肽苦味強度就越大［4］。干酪中苦味肽的產生主要與凝乳酶和發酵劑有關［5］。干酪成熟過程中酪蛋白降解程度的增加或者降解過程中形成的中間產物沒有被充分降解時，將會產生苦味肽。干酪中積累的苦味肽超過一定閾值后，干酪將產生苦味。干酪苦味影響了消費者的接受程度和市場前景，因此，基于重要的經濟原因，干酪苦味及苦味肽受到特別關注。

近年來，隨著先進分析技術的發展（如質譜），已鑒定出許多苦味肽。Guigoz等［6］從Swiss-Mountain干酪中分離到具有苦感的二肽。Broadbent等［7］認為苦味肽β-CN（f193-209）和αs1（f1-9）含量能夠作為Cheddar干酪和模擬干酪產生過度苦味的指標。Toelstede等［8-9］通過感官引導分級技術，在Gouda干酪中發現了有助于干酪產生苦味的12 種多肽。Karametsi等［10］通過凝膠色譜、半制備型反相液相色譜和串聯質譜在具有刺激性苦味干酪中鑒定出了5 種苦味肽。Liu Xiaowei等［11］利用液相色譜-飛行時間串聯質譜（liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-TOF-MS/MS）鑒定了乳清蛋白酶解產物中存在的苦味肽。

牦牛乳硬質干酪營養豐富、成熟期較長，且原料乳中有較高含量的β-酪蛋白（β-casein，β-CN）［12］，因此，鑒于不同干酪在原料乳、制作工藝、成熟方法等方面存在的差異，本研究通過提取牦牛乳硬質干酪中的苦味肽，采用葡聚糖凝膠色譜對其進行分離純化，結合感官評價和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）技術對其苦味肽組分進行鑒定，尋求干酪中存在的主要苦味肽，了解其苦味肽特征，為更好地控制牦牛乳硬質干酪苦味、獲得干酪良好風味提供相關數據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

15 ℃成熟4 個月的牦牛乳硬質干酪。

藍色葡聚糖2000、Sephadex G-25葡聚糖凝膠 美國GE公司；氯仿、甲醇（均為分析純） 天津市光復科技發展有限公司；硫酸奎寧（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；甲酸（分析純）、乙腈（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

1.6mm×75 cm普通層析柱 上海基星生物科技有限公司；MODEL BSZ-160自動部分收集器 上海青普滬西儀器廠；754PC型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；RE-5205旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；GLZ-0.4冷凍真空干燥機 北京速原中天科技有限公司；LTQ-Velos LC-MS/MS雙壓線性離子阱質譜儀美國Thermo Finnigan公司。

1.3方法

1.3.1干酪苦味肽的提取

參考Harwalkar等［13］方法，采用氯仿-甲醇法提取干酪中苦味肽，并將提取的苦味肽真空冷凍干燥后貯藏在-18 ℃備用。

1.3.2Sephadex G-25凝膠色譜分離純化

將苦味肽配制成70 mg/mL的溶液，上樣體積為1 mL，去離子水洗脫，洗脫速率為0.5 mL/min，每管收集體積為4.0 mL，檢測波長為220 nm，收集液通過旋轉蒸發濃縮后進行后續實驗。

1.3.3苦味肽各組分的苦味程度評價

經過培訓和感官能力測試后，篩選出7 人組成評價小組，以0、2.9×10-3、5.8×10-3、1.2×10-2、2.4×10-2mmol/L硫酸奎寧作為參比溶液，評定員由弱到強地品嘗參比溶液，記住每種溶液的苦味程度。采用5 分制進行評定、打分，1～5 分表示干酪苦味程度為幾乎檢測不到苦味、輕微苦味、中等苦味、非常強的苦味、令人難以接受的苦味。為了在相同條件下品嘗苦味肽的苦味程度，在評定之前，將其配成相同濃度的苦味肽樣品。評定員用蒸餾水漱口之后，將1 mL苦味肽溶液含在嘴里，大約10 s后吐出，進行評定、打分。

1.3.4LC-MS/MS鑒定苦味肽特征

液相條件：分離柱為RP柱（150 μm×100 mm，5 μm）。流動相A：0.1%甲酸-水溶液；流動相B：0.1%甲酸-乙腈；上樣量為20 μg，流速為2 μL/min；線行梯度洗脫：0～50 min，4%～50% B；50～54 min，50%～100% B；54～60 min，維持100% B。

LTQ Velos質譜儀通過微噴霧接口接到LC設備上，二級質譜數據同時獲得。全掃描范圍m/z 300～1 800，每次全掃描后采集20 個最強離子碎片圖譜，動態排除設置：重復點2；重復持續時間30 s；排除重復時間90 s。二級質譜數據自動通過BioworksBrowser rev. 3.1在ipi.HUMAN.v3.53中獲得。SEQUEST檢索結果再用Build Summary軟件進行比較，整合刪除冗余信息，保證數據的正確性。

針對LC-MS/MS鑒定出的苦味肽，根據構成它的氨基酸種類和數目，參考Ney［14］的方法計算苦味肽的平均疏水性值（Q）。具體計算公式如下：

式中：Δft為氨基酸自由能改變量；n為肽中氨基酸殘基數目。

1.4數據統計分析

數據采用SPSS軟件進行顯著性分析，Origin 8.0軟件進行作圖。

2　結果與分析

2.1Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離純化結果

圖1　牦牛乳硬質干酪苦味肽的Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜圖Fig. 1 Sephadex G-25 gel filtration chromatogram of bitter peptides in hard cheese made from yak milk

由圖1可知，提取到的苦味肽經Sephadex G-25葡聚糖凝膠，被分離成3 個組分。依據苦味肽洗脫的前后順序，將3 個組分分別命名為組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

2.2干酪中苦味肽各組分苦味程度的比較

圖2　Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離的各組分苦味程度的比較Fig. 2 Comparison of bitterness of different components separated by Sephadex G-25 gel column chromatography

由圖2可知，苦味肽組分Ⅱ具有輕微苦味，其苦味程度強于組分Ⅰ和組分Ⅲ。苦味肽組分Ⅱ與組分Ⅰ、Ⅲ之間的苦味程度差異顯著（P＜0.05），苦味肽組分Ⅰ、Ⅲ之間的苦味程度差異不顯著（P＞0.05）。

在該實驗中，算法使用RBF核函數，其中C=120，gamma=0.02。用10組真實數據交叉驗證得到經驗誤差為x=0.012, y=0.009；真實誤差值為ΔE= 1.21。

2.3苦味肽組分Ⅱ的LC-MS/MS鑒定

通過LC-MS/MS對苦味肽組分Ⅱ進行分離鑒定，得到的樣品基峰離子流色譜見圖3。在質譜分析過程中，精確質量數掃描可以確定離子所帶電荷數，利用二級質譜得到的碎片離子可識別肽段的氨基酸序列。通過與數據庫搜索匹配，結合肽片段檢測頻次和文獻［15］報道，篩選出17 種多肽，其具體結果見表1。

圖3　Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離的苦味肽組分Ⅱ的基峰離子流色譜圖Fig. 3 Base peak ion chromatography of fraction II separated by Sephadex G-25 gel filtration chromatography

表1　Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜分離的苦味肽組分Ⅱ中鑒定的特征肽段Table 1 Specific peptide sequences identified in fraction II separated by Sephadex G-25 gel filtration chromatography

由表1可知，大部分匹配的多肽源自酪蛋白，組分Ⅱ中存在的特征肽均為氨基酸殘基數目7～17 個、分子質量小于2 000 D的肽段，其中分子質量在800～1 500 D的肽段為苦味肽的主要部分，占71%。各肽段中氨基酸出現頻率較高的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸。苦味肽主要源自β-CN和αs1-酪蛋白（αs1-CN）的降解產物，特別是β-CN。源自于β-CN降解產物的肽鏈13 條，其中大部分主要源自C末端多肽的降解，且肽段中的疏水性殘基比例在71%以上。由于在所有牛乳蛋白中β-CN最疏水，而其C末端序列又是β-CN肽鏈中最疏水的［16］，因此比較容易產生苦味肽。源自于αs1-CN降解產物的苦味肽肽鏈有4 條，主要源自多肽的N末端降解，且肽段中的疏水性殘基比例在62%以下。

2.4組分Ⅱ中各苦味肽疏水性值分析

一般通過肽的疏水程度可以判斷其是否具有苦味，當疏水性氨基酸殘基裸露在肽鏈表面時，刺激舌上的苦味受體（味蕾）產生苦味。因此，按照Ney［14］的方法，計算出苦味肽組分Ⅱ中17 種多肽的疏水性值，見表2。

表2　牦牛乳硬質干酪中苦味肽組分Ⅱ中所鑒定特征肽的疏水性值（Q）Table 2 Hydrophobicity of characteristic peptides from fraction II

由表2可知，除了來自αs1-CN降解產物IKHQGLPQ、HQGLPQE、SDIPNPIGSENSG的多肽Q值＜5 443.1 J/mol之外，其他14 種多肽的Q值＞5 861.8 J/mol。因此，根據Q值規則，苦味肽組分Ⅱ中存在14 種具有苦味的肽，源自β-CN降解產物的苦味肽占92.86%，800～1 500 D苦味肽占64.29%。

3　討 論

Champion等［1］發現Cheddar干酪中苦味肽分子質量為190 D。Engel等［17］通過消除實驗，確定苦Camembert干酪的苦味主要由400～3 000 D的小肽所引起。Topcu等［18］利用超濾、凝膠色譜和反相高效液相色譜從Turkish白干酪和Kasar干酪中分離的苦味肽分子質量為500～4 000 D和200～700 D。來自血紅蛋白、玉米蛋白、酪蛋白和大豆蛋白等降解物的苦味肽也是由2～27 個氨基酸殘基組成，分子質量為200～3 000 D。因此，牦牛乳硬質干酪中苦味肽分子質量（875.09～1 881.25 D）在所報道的苦味肽分子質量范圍之內。

Edwards等［19］發現來自Cheddar干酪的苦味肽中具有較高含量的谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸和纈氨酸，而組氨酸、酪氨酸和甲硫氨基酸的含量較低。Toshikazu等［20］在大豆蛋白苦味肽的研究中也發現，纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸含量較高。Fitzgerald等［21］發現苦味肽中含有較多的脯氨酸。本實驗發現苦味肽序列中疏水性氨基酸頻數從高到低的順序依次為脯氨酸、纈氨酸和亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸。肽的苦味作用主要取決于肽側鏈末端的疏水性氨基酸殘基，這具備了與苦味受體結合的前提條件。疏水性氨基酸殘基在多肽中比例越高，則該多肽苦味越重［22］，而在本實驗中測定的大多數肽段中疏水性殘基比例在71%以上，這使得多肽的苦味程度可能較強。

另外，苦味肽的苦味還與特定分子構象相關。當多肽鏈兩端形成回折構象時，苦味較重，而脯氨酸（Pro）殘基對多肽鏈形成回折構象起著重要的作用［23］。本實驗發現大部分鑒定出的多肽末端部位多次出現疏水性氨基酸如脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸等，且脯氨酸出現的頻率很高。在—Pro—Pro—基團間插入L-型或疏水性氨基酸時苦味并不減弱，插入苯丙氨酸時，苦味將大大增強［24］。本實驗測定的苦味肽序列如YQEPVLGPVRGPFPIIV、YQEPVLGPVRGPFPII、Q E P V L G P V R G P F P、Y Q E P V L G P V R G P F P、V Y P F P G P I P N、Q E P V L G P V R G P F P I I、EPVLGPVRGPFPII中發現在脯氨酸和脯氨酸基團之間插入了疏水性氨基酸或者苯丙氨酸。在牦牛乳硬質干酪中發現存在YQEPVLGPVRGPFPIIV序列，而苦味肽β-CN（f193-209）的序列為YQQPVLGPVRGPFPIIV，將Q變成E，因此可判斷YQEPVLGPVRGPFPIIV具有苦味。在重口味Cheddar干酪［10］和Gouda干酪［8］中發現的苦味肽YQEPVLGPVRGPFPI也存在于牦牛乳硬質干酪中。同時還存在與YQEPVLGPVRGPFPI 前后差1或2 個氨基酸肽段YQEPVLGPVRGPFPII、QEPVLGPVRGPFPII、YQEPVLGPVRGPFP、EPVLGPVRGPFPII、QEPVLGPVRGPFP等。Karametsi等［10］發現GPVRGPFPIIV是重口味Cheddar干酪中苦味程度的主要貢獻者。Singh等［25］曾發現與β-CN（f193-209）相關的降解物β-CN（f196-209）、β-CN（f200-209）、β-CN（f202-209）的苦味閾值低于β-CN（f193-209）。Broadbent等［26］在Cheddar干酪中發現的αs1-CN（f1-7）有助于干酪產生苦味，而在牦牛乳硬質干酪中也發現了類似的多肽序列RPKHPIK。

綜上所述，本實驗所測定的牦牛乳硬質干酪中苦味肽具有呈現苦味的特征，且苦味較強的多肽主要有RPKHPIK、YQEPVLGPVRGPFPIIV、Q E P V L G P V R G P F P、Y Q E P V L G P V R G P F P、VYPFPGPIPN、QEPVLGPVRGPFPII、LPPTVMFPPQ、YQEPVLGPVRGPFPI、TPVVVPPFL、VYPFPGPIPN。

4　結 論

Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜將苦味肽分離成3 個不同分子質量的組分，且組分Ⅱ具有明顯苦味。經LC-MS/MS對組分Ⅱ進行鑒定，組分Ⅱ中有14 種苦味肽，主要是氨基酸殘基數目為7～17 個、分子質量小于 2 000 D的小肽，其中800～1 500 D的苦味肽占64.29%，苦味肽序列中出現的疏水性氨基酸頻數從高到低依次為脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸，源自β-CN的降解產物的苦味肽占92.86%。

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Separation and Characterization of Bitter Peptides from Hard Cheese Made from Yak Milk

SONG Xuemei1，2， ZHANG Yan1，2， YANG Min2，3， LIANG Qi1，2，*
（1. College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2. Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu， Lanzhou 730070， China；3. College of Science， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

The intention of this work was to investigate the structural characteristics of bitter peptides in hard cheese made from yak milk. Bitter peptides were extracted with chloroform-methanol mixture and isolated by using gel chromatography，and the more bitter fractions were identified by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS-MS）. The results showed that three fractions named as fractions I， II and III were obtained through Sephadex G-25 column chromatography and fraction II tasted the most bitter among these and had a flavor described as slightly bitter. Fourteen peptides were identified in fraction II and these peptides were composed of 7-17 amino acid residues in a molecular weight range less than 2 000 D. Hydrophobic amino acids such as proline， valine， leucine， phenylalanine and isoleucine constituted these bitter peptides. The bitter peptides in a molecular weight range of 800-1 500 D accounted for 64.29% and bitter peptides derived from β-casein（β-CN） accounted for 92.86%. Therefore， polypeptides derived from β-casein with high hydrophobicity and molecular weight below 2 000 D may have a significant influence on the bitterness of cheese.

hard cheese made from yak milk； bitter peptide； characteristic； β-casein

10.7506/spkx1002-6630-201615027

TS252.1

A

1002-6630（2016）15-0160-05

2015-10-20

國家自然科學基金地區科學基金項目（31260383）

宋雪梅（1980—），女，博士，研究方向為乳品科學與技術。E-mail：springwinter110@126.com

梁琪（1969—），女，教授，博士，研究方向為食品品質、乳品科學。E-mail：liangqi@gsau.edu.cn

引文格式：