蓮子紅衣多糖的分離純化及結構表征

高 航，高延芬，徐 虹，*

（1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048；2.深圳市農科集團有限公司，廣東 深圳 518040）

蓮子紅衣多糖的分離純化及結構表征

高 航1，高延芬2，徐 虹1，*

（1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048；2.深圳市農科集團有限公司，廣東 深圳 518040）

以蓮子紅衣為實驗對象，將其中的多糖進行分離、純化并表征結構。采用酶提醇析法提取蓮子紅衣粗多糖，選擇DEAE-C陰離子交換樹脂和Sephadex G-25凝膠柱層析，從蓮子紅衣粗多糖中分離純化得到中性多糖和酸性多糖兩種組分。經凝膠滲透色譜測定，中性和酸性多糖的重均分子質量分別為3.78×104D和4.94×104D，純度分別為91.16%和90.24%。中性多糖組分由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖4 種單糖組成；酸性多糖組分由葡萄糖、木糖、半乳糖、巖藻糖、阿拉伯糖5 種單糖組成。紅外光譜證明兩種多糖中均含有糖類特征吸收峰，且為α構型的吡喃型多糖。核磁共振氫譜檢測又進一步證實了兩種多糖均為α構型。

蓮子紅衣；多糖；分離純化；結構表征

高航， 高延芬， 徐虹. 蓮子紅衣多糖的分離純化及結構表征［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 94-99. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615016. http://www.spkx.net.cn

GAO Hang， GAO Yanfen， XU Hong. Separation， purification and structural characteristics of polysaccharides from red skin of lotus seeds［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 94-99. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615016. http://www.spkx.net.cn

蓮子又名水芝丹，屬睡蓮科蓮屬（Nympheaceae nelumbo Adans），是水生蔬菜栽培中的特種挻水宿根經濟植物。蓮子是中國傳統的滋補佳品，具有多種保健功效［1-2］。蓮子的加工通常經過干燥、分級、去殼、去皮心等工序，一般采用手工和機械磨皮兩種方式，但是在加工過程中會產生大量蓮子殼、蓮子紅衣等副產物［3］。經測定，蓮子紅衣中營養成分和活性物質的含量較高［3-6］，但并未得到有效利用，造成了資源浪費及環境污染。多糖是由單糖聚合形成的糖類，是自然界中分子結構復雜的一類高分子化合物，廣泛存在于動物和植物中，它是維持生命機體正常運轉的物質之一。植物、海洋生物及菌類等來源的多糖已作為具有生物活性的天然產物中的一個重要類型出現，各種多糖所具有的抗腫瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相繼被發現［7-9］。據報道，香菇多糖、苦瓜多糖、茶多糖等天然植物多糖表現出了很好的功能性［10-12］，具有極高的開發前景和應用價值。然而到目前為止，雖然國內外對多糖的研究日益重視，但就其研究的層次和水平來說，與蛋白質和核酸相比還有很大的差距。因此，對多糖結構的深入研究將為探討發展多糖類藥物及功能性食品奠定基礎。

本研究擬以蓮子紅衣為原材料，提取蓮子紅衣多糖，分離純化后對其分子質量和結構進行表征，以為日后深入探索植物多糖的分子修飾、構效關系以及功能性食品的研發提供理論基礎，同時可為蓮子紅衣的開發利用提供科學指導，使蓮子加工副產物得到充分利用，從而減少資源浪費。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蓮子紅衣 湖南三湘貿易有限公司。

DEAE-C 上海金穗生物科技有限公司；Sephadex G-25 美國法瑪西亞公司；透析袋 美國GE公司；α-淀粉酶 北京奧博星生物技術有限責任公司；溴化鉀、單糖標準品 上海源葉生物科技公司；苯酚 汕頭市西隴化工廠有限公司；硫酸、鹽酸、乙醇 北京化工廠；氫氧化鈉 天津光復科技發展有限公司；三氯乙酸國藥集團化學試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

R-3型旋轉蒸發器 瑞士Büchi公司；FreeZone-12L美國Labconco公司；層析柱（50 cm×2.6 cm、120 cm×1.6 cm）、DBS-100電腦全自動部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；Synergy H1全功能酶標儀 美國BioTek公司；高效凝膠色譜分析系統日本島津公司；DAWN HELEOS-II 型激光多角度散射檢測器、Optilab rex示差檢測器 美國Wyatt公司；Shodex SB-806M高效凝膠色譜柱 日本Shodex公司；Bruker AV 600核磁共振儀 德國Bruker公司。

1.3方法

1.3.1蓮子紅衣多糖的提取

稱取一定量過80 目篩的蓮子紅衣粉，按一定比例加入蒸餾水，充分攪拌后于恒溫水浴鍋中加熱。待加熱到55 ℃時按0.1 mg/g比例加入α-淀粉酶酶解（即每克蓮子紅衣粉加入0.1 g α-淀粉酶），酶解一定時間后，用電磁爐煮沸10 min，以終止酶繼續反應，冷卻后抽濾，取濾液加入6%三氯乙酸，在4 000 r/min的條件下離心15 min。取上清液加入5 倍體積的95%乙醇沉降過夜。次日，在4 000 r/min條件下離心15 min，取沉淀物先在-20 ℃預凍，之后冷凍干燥48 h，即得蓮子紅衣粗多糖。

1.3.2DEAE-C樹脂的預處理

稱取所需DEAE-C，用蒸餾水浸泡過夜，每5 h換水一次，且去除上層細小漂浮物，去離子水洗至泡沫很少時為止，濾干，先用0.05 mol/L HCl溶液浸泡過夜，用無離子水漂洗，再改用0.05 mol/L NaOH溶液浸泡過夜，用無離子水洗凈，pH試紙檢測中性即可使用。

1.3.3蓮子紅衣中性和酸性多糖的分離

DEAE-C預處理后上柱。配制8 mg/mL的粗多糖溶液100 mL，濾過0.45 μm濾膜，以2 mL/min速率進樣，待上樣完畢后，先用去離子水洗脫，使未與陰離子交換劑結合部分流出，即得到中性多糖；后改為0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫，使與陰離子交換劑結合部分流出，得到酸性多糖。此后，再分別進行0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L NaCl梯度洗脫，但是幾乎不再有峰出現，當采用0.1 mol/L的NaOH洗脫時，其對DEAE-C填料的穩定性有影響。因此，僅用0.1 mol/L NaCl溶液進行洗脫。每管洗脫液取200 μL，加入9%的苯酚溶液和硫酸（體積比1∶5），沸水浴20 min，于490 nm波長處測吸光度。繪制管數與吸光度曲線，并按峰型合并陽性部分。

1.3.4蓮子紅衣中性多糖的純化

采用Sephadex G-25層析柱純化，根據多糖分子質量的不同，可對蓮子紅衣中性多糖進一步純化。首先，分別進行流速和上樣量的最佳條件選定，然后根據最佳純化條件進行純化。將中性多糖溶于1 mL去離子水中，得到30 mg/mL的多糖溶液，用滴管小心加入層析柱中，用去離子水洗脫，流速為0.25 mL/min，同時每5 min收集1 管流出液，根據苯酚-硫酸法繪制洗脫曲線，并按峰型合并洗脫液。

1.3.5純度及重均分子質量的檢測

采用最佳的洗脫流速和上樣量進行分離純化，隔管通過苯酚-硫酸法測定吸光度并繪制洗脫曲線，按照峰型合并陽性部分，冷凍干燥即得到純化后的多糖組分。采用凝膠色譜示差檢測器和激光多角度散射器檢測多糖的純度和重均分子質量。

凝膠滲透色譜條件：色譜柱為Shodex SB-806M（7.8 mm×300 mm）；流動相為0.1 mol/L硝酸鈉溶液；流速為0.5 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣體積為200 ?L；檢測器為示差器及激光多角度散射檢測器。

1.3.6蓮子紅衣多糖的單糖組成分析［13-15］

分別移取7 種標準單糖溶液與NaOH溶液混合均勻。取混合后的溶液100 μL于5 mL的具塞試管中，加0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液漩渦式混勻，在75 ℃的恒溫鼓風干燥箱中反應2 h，取出后冷卻至室溫。隨后加入0.3 mol/L的鹽酸溶液10 mL中和，蒸干。加入氯仿和水各2 mL，混合搖勻，待分層后棄去氯仿層，重復萃取3 次后即可進樣。

移取100 μL質量濃度為2 mg/mL的多糖樣品，加入100 μL三氟乙酸，充氮氣封管，在恒溫鼓風干燥箱中110 ℃水解2 h，冷卻至室溫后加200 μL甲醇溶液后旋轉蒸干，重復操作以去除三氟乙酸，之后加入NaOH溶液將殘渣充分溶解，然后再加入100 μL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液，在恒溫鼓風干燥箱中70 ℃反應2 h，冷卻后完成中和、萃取操作即可進樣。

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測條件：Shodex SB-230色譜柱（8.0 mm×300 mm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流動相A：高純水，流動相B：乙腈，流動相A與B（83∶17，V/V）；進樣量：10 μL。

1.3.7蓮子紅衣多糖的紅外光譜分析

分別稱取分離純化后得到的中性多糖及酸性多糖，各按質量比1∶100的比例與干燥的KBr混勻，在瑪瑙研缽中研磨5～10 min。混合壓膜，測定波數在4 000～400 cm-1的紅外光譜，實驗中均采用干燥的KBr作為背景。

1.3.8蓮子紅衣多糖的核磁共振氫譜分析

將一定量的兩個多糖純品分別溶于D2O中，在293 K溫度下進行600 Hz的核磁共振儀分析。

2　結果與分析

2.1蓮子紅衣中性和酸性多糖的分離結果

圖1　蓮子紅衣中性多糖（Ⅰ）和酸性多糖（Ⅱ）在DEAEE--CC樹脂上的洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of water-soluble crude polysaccharides on DEAE-C column

按照1.3.3節方法將蓮子紅衣粗多糖經DEAE-C離子交換層析分離后，采用苯酚-硫酸法隔管測定糖含量并作與所對應管號的曲線圖。由圖1可知，7～27 管內的多糖是未與陰離子交換劑結合的部分，經合并，凍干，為中性多糖，得到28 mg；59～75 管為0.1 mol/L NaCl洗脫部分，經合并，攪拌透析48 h，中間換水一次，凍干，為酸性多糖，得到25 mg，所得中性多糖的提取率為13.56%，酸性多糖的提取率為8.49%。

2.2凝膠柱層析的純化結果

2.2.1洗脫流速的選擇

以葡聚糖凝膠Sephadex G-25為分離介質，上樣1 mL，在30 mg/mL恒定上樣量條件下，選擇0.1、0.25、0.4 mL/min這3 種流速以確定純化中性多糖的最佳分離條件。從圖2可以看出，在選定的3 個流速下均能使陽性部分分離開來。但在0.10 mL/min的流速下，分離時間較長；0.25 mL/min能將時間縮短近一半，且分離效果較好；0.40 mL/min流速下，可在較短時間內完成分離，但是陽性部分出現拖尾現象。因此最終選擇流速為0.25 mL/min進行純化。

圖2　不同流速的洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of the neutral polysaccharide at different flow rates

2.2.2上樣量的選擇

以葡聚糖凝膠Sephadex G-25為分離介質，在0.25 mL/min的恒定流速下，選擇15、30、45 mg/mL這3 種上樣量以確定最佳分離條件。由圖3可知，3 種上樣量均可使中性多糖完全分離，但當上樣量為15 mg/mL時，為達到目標樣品量，所需純化次數較多，耗時較長。當上樣量為45 mg/mL時，與其他峰間隔較小，且有輕微的拖尾現象。為保證實驗重現性及準確性，最終選定30 mg/mL為最佳上樣量。

圖3　不同上樣量的洗脫曲線Fig. 3 Elution curves of the neutral polysaccharide at different sample loading amounts

2.3高效凝膠柱層析的純化結果

圖4　蓮子紅衣中性多糖（a）和酸性多糖（b）的高效滲透凝膠圖譜Fig. 4 GPC chromatograms of the neutral （a） and acidic （b） polysaccharides

如圖4可知，曲線Ⅰ顯示的是DAWN HELEOS-Ⅱ型激光多角度散射檢測器的信號，測定的是各個組分分子質量的大小；曲線Ⅱ顯示的是Optilab rex示差檢測器的信號，測定各個組分質量濃度。中性多糖（圖4a）包含兩種分子質量組分，保留時間分別為15 min和20 min。但從曲線Ⅱ得知，保留時間為15 min的物質，分子質量較大，但含量極少；而保留時間為20 min的物質，含量極高。酸性多糖（圖4b）中也存在大分子物質，但含量較低。此外，通過示差信號顯示出的兩種多糖的圖譜分別為單一對稱峰，進一步說明了均一性良好。通過曲線積分面積分別計算得出中性及酸性多糖的純度分別為91.16%和90.24%。由激光信號測得重均分子質量分別為3.78×104D和4.94×104D，分散系數為1.12，均一性較好。

2.4蓮子紅衣中性和酸性多糖的單糖組成分析

從化學結構上分析，酸性多糖鏈除了含酸性基團外，可能還含有中性單糖或堿性單糖。至于酸性多糖中酸性基團和比例或者其酸度目前都沒有明確規定，文獻［16］中一般把含有酸性基團的多糖都稱為酸性多糖。由圖5及表1可知，酸性多糖較中性多糖來說，成分較為復雜，而酸性多糖中含有的阿拉伯糖等也均為酸性糖，中性多糖中則以葡萄糖為主，而酸性多糖以木糖為主，同時葡萄糖所占比例也較高。

圖5　蓮子紅衣中性多糖（a）和酸性多糖（b）的單糖組成色譜圖Fig. 5 Monosaccharide composition analysis of the neutral （a） and acidic （b） polysaccharides

表1　蓮子紅衣中性和酸性多糖的單糖組成及含量Table 1 Monosaccharide compositions of the neutral and acidic polysaccharidesrides mg/g

2.5蓮子紅衣中性和酸性多糖的紅外光譜分析

圖6　蓮子紅衣中性多糖（a）和酸性多糖（b）的紅外光譜Fig. 6 Infrared absorption spectra of the neutral （a） and acidic （b）polysaccharides

由圖6可知，3 300 cm-1左右出現的寬峰為糖類物質O—H的伸縮振動（γOH）；2 900 cm-1左右出現的峰為烷基中C—H鍵的伸縮振動（γCH），1 360 cm-1附近出現C—H的彎曲振動峰（δCH）為旁證，而酸性多糖中未出現該峰，說明不存在亞甲基或甲基；在1 400～1 200 cm-1

范圍內所看到的不太尖的吸收峰1 361.23 cm-1是C—H的變角振動；1 640 cm-1附近的峰為酯羰基中C—O鍵的伸縮振動峰（γCO）；1 148、1 076、997 cm-1左右出現了較強的3 個吸收峰，在1 100～1 000 cm-1范圍內出現3 個強峰為吡喃環的特征吸收峰，其中1 077 cm-1和997 cm-1為吡喃糖環的醚鍵（C—O—C）伸縮振動和羥基（C—O—H）的吸收峰；928 cm-1附近的吸收峰也進一步證實了吡喃糖中糖苷鍵C—O—C為非對稱環；紅外光譜在890 cm-1附近無吸收峰，而在848 cm-1有吸收峰，這也是存在α-D-吡喃糖的旁證。另外，在875 cm-1和810 cm-1無吸收峰，表明不含甘露吡喃糖和半乳吡喃糖。而759 cm-1的吸收峰也再次證實了其結構中含有吡喃糖。

2.6蓮子紅衣中性和酸性多糖的核磁共振氫譜分析

圖7　蓮子紅衣中性多糖（a）和酸性多糖（b）的核磁共振氫譜Fig. 71H-NMR spectra of the neutral （a） and acidic （b） polysaccharides

核磁共振波譜法是利用自旋原子核在外磁場作用下的核自旋能級間躍遷所吸收的電磁波譜來研究化合物結構與組成的分析方法。核磁共振氫譜主要解決多糖結構中糖苷鍵構型及結構中氫個數比的問題，但是由于非異頭質子化學位移δ相近，且有部分重疊現象，使多數質子信號較難解析。一般來說，α構型糖苷的異頭質子的化學位移δ大于5.0，而β構型的異頭質子的化學位移δ小于5.0［17］，由圖7可知，中性和酸性多糖組分為α構型。

3　討 論

本實驗采用的多糖分離純化方法簡單可靠，中性多糖提取率為13.56%，酸性多糖提取率為8.49%。由于中性及酸性多糖具有不同的功能性，因而眾多學者將其進行分離純化。芮海云等［18］研究顯示白芨中性多糖能有效清除羥自由基（·OH），并呈量效關系；對D-半乳糖所致小鼠體質量負增長和體內超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性下降有顯著抑制作用。劉曉宇［19］的研究顯示，經硫酸化和羧甲基化修飾的黃藥子中性多糖可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。酸性多糖由于含有糖醛酸這一特殊結構，使得其具有特殊生理活性。另有研究顯示，酸性多糖具有明顯的抗炎活性、抗氧化活性等，且隨其糖醛酸含量的增加逐漸增強［20-21］。

對于多糖的純化步驟，木瓜蛋白酶-Sevag法效果最好，反應較溫和，可同時實現高蛋白脫除率和低多糖損失率的目標［18］，然而受到木瓜蛋白酶價格昂貴等多種因素影響，三氯乙酸法目前也成為脫除多糖中蛋白的常用方法［19］。本研究采用了DEAE-C柱層析將中性和酸性多糖分離出來，雖然純度有了一定的提高，但是仍存在一些雜質。因而又使用葡聚糖凝膠Sephadex G-25凝膠柱進行純化精制，純度可達到較高的水平。

多糖的結構檢測手段很多，本研究主要采用凝膠滲透色譜的方法分析了蓮子紅衣多糖的分子質量及純度，通過本實驗方法得到的多糖均一性較好；紅外光譜及核磁共振分析了其糖鍵結構，表明蓮子紅衣多糖具有糖類物質的特征吸收峰且為α構型；采用衍生的方法分析了其單糖組成，為蓮子紅衣多糖產品的開發和利用提供了理論依據。

目前對于多糖的研究多集中在其特征官能團和單糖組成方面，但是對于多糖糖苷鍵構型、連接方式等的研究上還遠遠不夠［20］，這一原因主要是由于分析以上兩種結構的步驟繁瑣，并且多糖甲基化方法分析糖苷鍵構型中，多糖不能完全甲基化也是研究中的一個瓶頸問題。此外，受到不同研究者選用的原料不同、分離提取方法不同等因素的影響，得到的單糖組成及含量會有一定的差異［21-22］。對于多糖的純度檢測，由于目前尚未找到合適的標準品，因此通過各種檢測方法得到的多糖純度仍然是較為粗略的結果，日后也期待找到更加方便、重復性更高的方法以解決多糖的結構解析。

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Separation， Purification and Structural Characteristics of Polysaccharides from Red Skin of Lotus Seeds

GAO Hang1， GAO Yanfen2， XU Hong1，*
（1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health， Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China； 2. Shenzhen Nongke Group Co. Ltd.，Shenzhen 518040， China）

The crude polysaccharides isolated from the red skin of lotus seeds by enzymatic extraction and ethanol precipitation were separated into neutral and acidic polysaccharides by DEAE-C column chromatography and subsequent Sephadex G-25 gel column chromatography. Gel permeation chromatography （GPC） analysis showed that the molecular weights of the neutral and acidic polysaccharides were 3.78 × 104D and 4.94 × 104D with a purity of 91.16% and 90.24%，respectively. The neutral polysaccharide was composed of 4 monosaccharides including glucose and xylose， while the acidic polysaccharide was mainly composed of 5 monosaccharides including glucose， xylose and galactose. Infrared spectra preliminarily confirmed that both purified fractions were pyranoses with α configuration. This conclusion was further proved by nuclear magnetic resonance.

red skin of lotus seeds； polysaccharide； separation and purification； structural characterization

10.7506/spkx1002-6630-201615016

TS201.2

A

1002-6630（2016）15-0094-06

2015-09-20

北京市自然科學基金項目（6162003）；北京市屬高等學校創新團隊建設與教師職業發展計劃項目（IDHT20130506）作者簡介：高航（1992—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：gaohang0928@163.com

徐虹（1977—），女，副教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：xuhong@th.btbu.edu.cn

引文格式：